玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、本試驗材料玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63為劉大群教授從美國明尼蘇達州馬鈴薯瘡痂病菌自然衰退的土壤中分離到一株生防鏈霉菌。為了建立玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，本論文研究了PEG-介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、接合轉(zhuǎn)移、電轉(zhuǎn)化等方法的影響因素和轉(zhuǎn)化條件。首先對玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63的原生質(zhì)體制備和再生條件進行了研究，結(jié)果表明，菌絲體二級培養(yǎng)有利于原生質(zhì)體的形成，采用TSB作為一級培養(yǎng)基28℃20

2、0rpm搖床震蕩培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)接到二級培養(yǎng)基中補加2％的甘氨酸28℃200rpm繼震蕩培養(yǎng)40h；采用玫瑰黃鏈霉菌原始培養(yǎng)基、YEME、CRM、R<,3>、R<,2>YE、CP、SGGP、GPYP 8種培養(yǎng)基中進行二級培養(yǎng)，表明SGGP培養(yǎng)基適合玫瑰黃鏈霉菌原生質(zhì)體制備的二級培養(yǎng)。其次，溶菌酶作用濃度為2mg/mL，37℃水浴60min，在此條件下，原生質(zhì)體的形成量可達到10<'7>～10<'8>No．/mL。原生質(zhì)體再生采用常規(guī)培養(yǎng)基

3、R<,2>YE，玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63原生質(zhì)體再生后產(chǎn)孢能力比較差，考察再生培養(yǎng)基R<,2>YE的成分及含量對原生質(zhì)體再生影響的研究表明，Ca<'2+>、Mg<'2+>是影響原生質(zhì)體再生的主要因素，R<,2>YE中Ca<'2+>濃度為100mmol/L、Mg<'2+>濃度為50mmol/L時，玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63再生數(shù)約為4.0×10<'6>/mL，再生率可達15％。嘗試使用鏈霉菌通用質(zhì)粒pIJ70

4、2轉(zhuǎn)化玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63原生質(zhì)體，參照變鉛青鏈霉菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法不能獲得轉(zhuǎn)化子，因此本文研究了影響政瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的因素，結(jié)果表明，PEG的來源和濃度是影響轉(zhuǎn)化的主要因素，PEG-4000可以介導(dǎo)玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，但是轉(zhuǎn)化率特別低，只有1.5×10<'-3>％。 本文還研究了玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63的接合轉(zhuǎn)移和電轉(zhuǎn)化

5、的方法。接合轉(zhuǎn)移研究表明，將具有oriT的大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒pKC1139轉(zhuǎn)入大腸桿菌ET12567(pUZ8002)中，獲得供體菌ET12567(pUZ8002，pKC1139)，將供體菌和預(yù)處理過的玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63孢子懸浮液進行混合培養(yǎng)，成功的將pKC1139轉(zhuǎn)入到Men-myco-93-63中去，轉(zhuǎn)化率較高，可達到10<'3>～10<'4>轉(zhuǎn)化子/μg pKC1139。電轉(zhuǎn)化在一些植物和動物細胞中應(yīng)用