金柑遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立與應(yīng)用.pdf

1、浙江大學(xué)博士學(xué)位論文金柑遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立與應(yīng)用姓名：楊莉申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：果樹(shù)學(xué)指導(dǎo)教師：陳昆松徐昌杰20060401浙江大學(xué)博士學(xué)位論文(2006)：金柑遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立與應(yīng)用中文摘要金柑(，t。，f“”eⅣ盯口伽扣f砌swin91e)為蕓香科柑桔亞科金柑屬植物，原產(chǎn)中國(guó)。與其他柑桔類(lèi)植物相比，金柑童期較短，實(shí)生繁殖后約23年便可開(kāi)花結(jié)實(shí)，是用作研究果實(shí)性狀或利用轉(zhuǎn)基因體系研究基因功能的較理想的多年生木本植物材料。本研究以我

2、國(guó)金柑主栽品種‘金彈’為試材，建立了高效的再生體系、遺傳轉(zhuǎn)化體系和檢測(cè)技術(shù)體系，獲得了轉(zhuǎn)BcH反義基因及葉綠素酶基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因植株，并對(duì)轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行了分子鑒定。主要研究結(jié)果如下。(一)金柑高效再生體系的建立以‘金彈’成熟種子為試材，研究不同外植體類(lèi)型及放置方式、激素配比、糖濃度等因素對(duì)不定芽或根再生的影響，建立一套高效穩(wěn)定的組織培養(yǎng)再生體系。結(jié)果表明：上胚軸為最佳外植體，其再生不定芽頻率為68％，下胚軸和子葉的不定芽再生頻率均低于

3、10％；外植體在培養(yǎng)基中的放置方式以形態(tài)學(xué)上端向上最好，不定芽的再生頻率高出平放一倍以上；上胚軸在誘導(dǎo)不定芽的最佳培養(yǎng)基中，每外植體再生不定芽數(shù)可高達(dá)148個(gè)，且出芽時(shí)間相對(duì)較早，生長(zhǎng)健壯，無(wú)玻璃化現(xiàn)象；培養(yǎng)基中蔗糖濃度為25gL“時(shí)最有利于不定芽再生，隨蔗糖濃度提高，不定芽再生頻率降低，而不能分化的愈傷組織大大增加；再生芽在最佳生根培養(yǎng)基中生根30d可再生3，5條不定根，平均根長(zhǎng)度達(dá)18cm；長(zhǎng)成的完整植株在移苗咀前需經(jīng)7d以上時(shí)間煉

4、苗，直接移栽易導(dǎo)致再生植株萎蔫死亡。(二)金柑遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立建立了一套基于KaIl篩選的遺傳轉(zhuǎn)化體系：以培養(yǎng)約40d無(wú)菌苗的上胚軸為外植體：將刻傷的上胚軸在已稀釋至OD值為O5的農(nóng)桿菌菌液中浸泡30min，接種到不含抗生素的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)3—4d；共培養(yǎng)后的外植體先轉(zhuǎn)移至KaIl濃度較低的培養(yǎng)基(25mgL。)中篩選1個(gè)月，再繼代到砭a11濃度較高的培養(yǎng)基(50，100m2L‘1)中篩選：4—5個(gè)月后，將長(zhǎng)至O5。10cm的抗性芽嫁