銀杏GbGGPPS基因的克隆鑒定及其遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、銀杏內(nèi)酯是治療心腦血管疾病最有效的天然藥物之一，已引起了國際藥學(xué)界的廣泛關(guān)注，隨著相關(guān)研究的深入，銀杏內(nèi)酯有望成為治療休克、燒傷、過敏性哮喘、中風、移植排斥、血液透析等病癥的一類新藥。由于銀杏生長較慢且銀杏內(nèi)酯含量非常低，而市場對銀杏制品的需求量又大，所以目前完全不能滿足患者的需求。開展銀杏的基因工程為解決藥源缺乏的問題提供了嶄新的思路，而開展銀杏內(nèi)酯生物合成途徑的分子生物學(xué)研究是實現(xiàn)銀杏內(nèi)酯基因工程的重要工作。 銀杏內(nèi)酯的生物

2、合成起源于新近發(fā)現(xiàn)的MEP途徑。20碳單位的香葉基香葉基焦磷酸(Geranylgeranyl diphosphate，GGPP)是銀杏內(nèi)酯生物合成的直接前體，它由香葉基香葉基焦磷酸合成酶(Geranylgeranyl diphosphate synthse，GGPPS)催化生成。本文利用基因組步移的方法，克隆了包括完整ORF的GbGGPPS基因組序列，利用半定量RT-PCR對GbGGPPS進行表達譜分析，利用顏色互補驗證基因功能；并開展

3、了銀杏的遺傳轉(zhuǎn)化等工作，為研究銀杏內(nèi)酯前體生物合成途徑的分子生物學(xué)和開展銀杏內(nèi)酯的代謝工程奠立基礎(chǔ)。 本文克隆到了2135bp的GbGGPPS基因組序列，對GbGGPPS基因組結(jié)構(gòu)的分析表明該基因沒有內(nèi)含子，在其上游序列中發(fā)現(xiàn)了MeJA反應(yīng)元件(CGTCA)。該基因編碼區(qū)長為1176bp，編碼391個氨基酸的多肽；生物信息學(xué)分析表明GbGGPPS定位于質(zhì)體，在其氨基端具有長為79個氨基酸的質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽；GbGGPPS屬于異戊烯基轉(zhuǎn)

4、運酶家族，具有該酶家族特有的兩個天冬氨酸富集基序；分子系統(tǒng)進化分析表明植物的GGPPS分為被子植物和裸子植物兩種類型，GbGGPPS屬于裸子植物類型的GGPPS；對GbGGPPS的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬分析結(jié)果表明，GbGGPPS由大量的α—螺旋通過隨機卷曲連接而成，這些α—螺旋環(huán)繞形成一個袋狀空腔，其空腔口部為底物結(jié)合與碳鏈延伸的活性部位。利用半定量RT-PCR對GbGGPPS進行組織表達譜分析，結(jié)果表明GbGGPPS在銀杏根、莖、葉、樹皮和

5、果實中均有表達，但表達量差異較大，在根中表達量最高，在葉中表達量最低。用GbGGPPS的OFF序列替換pTrcAtIPI質(zhì)粒上的擬南芥IPI基因編碼區(qū)，獲得pTrcGbGGPPS質(zhì)粒；在大腸桿菌XL1—Blue中同時導(dǎo)入pACCAR25ΔcrtE質(zhì)粒和pTrcGbGGPPS質(zhì)粒，構(gòu)建了其β-胡蘿卜素的合成途徑。該菌在顏色互補平板上菌落呈現(xiàn)明亮的橘黃色。功能互補分析表明了GbGGPPS能推動工程菌XL1-Blue+pTrcGbGGPPS+

6、pACCAR25ΔcrtE超量表達β-胡蘿卜素，證實GbGGPPS具有典型的GGPPS基因的功能。該基因組的克隆和分析有助于在分子遺傳學(xué)水平上了解GbGGPPS的功能，為實現(xiàn)銀杏內(nèi)酯的基因工程提供了一個重要的基因和作用靶點。 為建立銀杏的遺傳轉(zhuǎn)化體系，本文采用載體pCAMBIA1304+分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌C58C1、LBA4404和EHA105，以成熟的銀杏種子胚為外植體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)將pCAMBIA1304+上的GUS基因轉(zhuǎn)入銀杏胚