萊氏野村菌侵染相關(guān)基因的篩選、遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及基因功能鑒定.pdf

1、萊氏野村菌[Nomuraea rileyi(Farlow)Samson]是一種重要的昆蟲病原真菌，在田間可以自然感染多種鱗翅目害蟲，引起害蟲域內(nèi)流行病，在生物防治中起到重要的作用，具有潛在的生物農(nóng)藥應(yīng)用前景。但萊氏野村菌殺蟲劑也存在防效緩慢、易受到環(huán)境因素的制約和干擾、產(chǎn)品有效期短、質(zhì)量穩(wěn)定性較差等缺點(diǎn)。因此通過(guò)基因工程的手段，利用有效的殺蟲靶標(biāo)對(duì)原有菌株進(jìn)行改良，構(gòu)建高效安全而且環(huán)境友好的的殺蟲工程菌已成為當(dāng)前該領(lǐng)域研究的重中之重。而

2、作為實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)的前期工作基礎(chǔ)，尋找有效殺蟲靶標(biāo)、研究萊氏野村菌侵染害蟲的分子機(jī)制以及真菌侵染與害蟲免疫的互作關(guān)系、探明殺蟲機(jī)理，無(wú)論是在闡明萊氏野村菌抵御害蟲免疫機(jī)制的基礎(chǔ)理論研究方面，還是在殺蟲靶標(biāo)基因的現(xiàn)實(shí)應(yīng)用方面都有著重要的意義。
　　論文以研究萊氏野村菌侵染夜蛾科害蟲斜紋夜蛾的分子機(jī)理，并提高萊氏野村菌的生防效果為主要目的，嘗試多種方法和途徑展開研究。取得的研究結(jié)果如下：
　?、偃R氏野村菌注射侵染斜紋夜蛾血淋巴后，分

3、離獲得處于不同發(fā)育時(shí)期的蟲菌體，利用DD-RT-PCR差異顯示技術(shù)，共獲得42條差異表達(dá)的片段。BlastX比對(duì)分析并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，克隆EST片段大小在47-542 bp之間，獲得的差異EST片段涉及真菌抵御昆蟲免疫系統(tǒng)、抗氧化、逃避宿主免疫、電子傳遞、細(xì)胞周期控制、壓力反應(yīng)、砷酸鹽還原、過(guò)氧化物膜蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂肪酸脫氫酶等功能基因。利用 qPCR的方法驗(yàn)證了各差異基因在不同時(shí)期的表達(dá)情況。定量PCR結(jié)果表明，差異顯示中基

4、因表達(dá)變化并不完全與qPCR檢測(cè)到的基因表達(dá)變化相同。
　?、诒菊撐牟捎?種方法獲得目標(biāo)基因的全長(zhǎng)序列：利用RACE技術(shù)擴(kuò)增差異表達(dá)基因的全長(zhǎng)；利用FPNI-PCR的方法，以gDNA為模板，迅速擴(kuò)增差異表達(dá)基因片段的上下游序列；另外通過(guò)本地BLAST的方法，在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序庫(kù)中比對(duì)得到cDNA序列。利用此類方法獲得了SR-RCI，PI-PLC，MCL1，NrFADS2等基因的cDNA全長(zhǎng)、gDNA序列和上下游序列。
　　本論文重

5、點(diǎn)研究了萊氏野村菌感染斜紋夜蛾后顯著上調(diào)表達(dá)的脂肪酸脫氫酶NrFADS2基因?；蛐蛄蟹治霰砻鳎摶蛐蛄兄泻腥齻€(gè)內(nèi)含子，開放閱讀框由1758 bp組成。NrFADS2基因編碼585個(gè)氨基酸組成的蛋白，含有membrane-FADs-like超家族蛋白保守的結(jié)構(gòu)域，包括N端的Cyt-b5結(jié)構(gòu)域和HPGG保守區(qū)域，以及中間區(qū)域和C末端的delta6-FADs-like結(jié)構(gòu)域。定量PCR試驗(yàn)表明， NrFADS2基因在萊氏野村菌侵染斜紋夜

6、蛾血淋巴的不同階段誘導(dǎo)表達(dá)。
　?、圻z傳轉(zhuǎn)化體系的建立是基因功能研究的重要前提，利用萊氏野村菌芽生孢子作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞，對(duì)轉(zhuǎn)化體系統(tǒng)的各種參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，篩選出了培養(yǎng)基中潮霉素的最適篩選濃度為450μg/mL，優(yōu)化了誘導(dǎo)劑乙酰丁香酮最適誘導(dǎo)濃度為200μM；對(duì)比了AGL-1，LBA4404，GV3101，C58等不同農(nóng)桿菌菌株對(duì)CQNr01菌株轉(zhuǎn)化效率，發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌菌株 GV3101具最高轉(zhuǎn)化效率；構(gòu)建了隨機(jī)插入載體pPZP-

7、Ptrpc-Hph和pPZP-Hph-DsRED2，第一次利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法成功將潮霉素抗性基因和紅色熒光蛋白導(dǎo)入萊氏野村菌CQNr01芽生孢子中，PCR和Southern雜交結(jié)果表明，目標(biāo)基因已成功整合到萊氏野村菌基因組中，建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的萊氏野村菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系。
　?、芾秒S機(jī)插入載體pPZP-Ptrpc-Hph和pPZP-Ptrpc-Hph-DsRED2，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化萊氏野村菌，構(gòu)建了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的萊氏野村菌的隨機(jī)插

8、入突變體庫(kù)，獲得了豐富的突變子表型，并利用FPNI-PCR獲得了突變子插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列，此方法對(duì)于當(dāng)前沒(méi)有明確基因組信息的萊氏野村菌來(lái)說(shuō)，可以從豐富的表型變化來(lái)研究基因的功能，打開了萊氏野村菌正向遺傳學(xué)研究的大門。
　　⑤在萊氏野村菌沒(méi)有基因組序列背景的條件下，利用FPNI-PCR法迅速擴(kuò)增目標(biāo)基因的側(cè)翼序列，構(gòu)建了敲除載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)，成功實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)基因的定點(diǎn)替換性敲除，建立了萊氏野村菌的基因敲除突變體系。
　?、弈?/p>

9、標(biāo)基因功能的鑒定離不開基因的回復(fù)體系。本論文利用FPNI-PCR的方法克隆了目標(biāo)基因的啟動(dòng)子序列，將啟動(dòng)子和ORF序列插入回復(fù)載體，構(gòu)建成基因回復(fù)載體；利用諾爾斯菌素抗性基因Sat1基因作為回復(fù)篩選的標(biāo)記基因，最終確立諾爾斯菌素的最適抑菌濃度為300μg/mL。
　?、叱醪借b定了野生型菌株、敲除菌株和回復(fù)菌株之間生理生化的變化和對(duì)斜紋夜蛾毒力的變化。研究結(jié)果表明，敲除NrFADS2基因影響菌株對(duì)脂肪酸的利用能力，降低了菌株抗氧化能