兩型性萊氏野村菌交替氧化酶(AOX)基因的克隆及功能研究.pdf

1、蟲生真菌因在防治農(nóng)林害蟲時具有對環(huán)境無污染、無殘留和使害蟲不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，是一種環(huán)境友好型真菌。隨著人們對環(huán)保意識的增強，利用蟲生真菌防治農(nóng)林害蟲受到人們的廣泛關(guān)注及重視。萊氏野村菌在田間能夠自然侵染多種夜蛾科害蟲并引起域內(nèi)流行病，是一種重要的昆蟲病原真菌。萊氏野村菌作為殺蟲劑的有效成分是分生孢子，但是由于其產(chǎn)孢條件比較苛刻如需要苛刻的碳源（麥芽糖）和持續(xù)光照，其工業(yè)化生產(chǎn)方面一直受到極大限制，所以尋找該菌的其他繁殖體來代替分生孢

2、子行使殺蟲作用具有十分重要的意義。液體發(fā)酵產(chǎn)生的芽生孢子雖然有一定侵染力，但因其細胞壁比較薄、不耐儲存以及毒力低等特點也不能用于生產(chǎn)實踐。微菌核是真菌菌絲聚集而形成特異休眠體結(jié)構(gòu)，它具有耐儲存、抗逆性強、在適宜的環(huán)境下能萌發(fā)產(chǎn)生菌絲和孢子。重慶大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室成功的誘導(dǎo)出萊氏野村菌的微菌核，并對其的抗逆性和毒力等進行了測試，實驗結(jié)果證實該微菌核可以作為有效的活性成分來代替分生孢子用于害蟲的生物防治制劑。其后，采用比較轉(zhuǎn)錄組技

3、術(shù)從分子層面來探討微菌核形成機理，發(fā)現(xiàn)在微菌核形成與氧脅迫密切相關(guān)，并且在微菌核形成的過程中大量的還原性酶或合成還原性物質(zhì)的基因上調(diào)表達。依據(jù)此，本課題從比較轉(zhuǎn)錄組上調(diào)表達的cDNA文庫中挑取Nraox基因的EST序列，將其克隆并采用RNA干擾技術(shù)來研究該基因在微菌核發(fā)育過程中的作用。主要研究結(jié)果如下：
　?、偃R氏野村菌Nraox基因的克隆與序列分析根據(jù)萊氏野村菌轉(zhuǎn)錄組庫中Nraox基因的EST序列，克隆得到該基因的cDNA全長序

4、列（GenBank登錄號：No.KM978957）。序列分析顯示其開放閱讀框為1068bp，編碼355個氨基酸；生物信息學(xué)分析表明該蛋白的理論分子量為40.517KD，理論等電點為9.53；該蛋白具有親水性，無信號肽，亞細胞定位分析該蛋白定位于線粒體內(nèi)。Nraox的基因組全長為1512bp，該基因含有3外顯子，2內(nèi)含子。利用DNAMAN和MEGA軟件進行同源比對和系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，萊氏野村菌的AOX蛋白與綠僵菌的同源性最高，并與麥角菌科

5、的真菌聚為一組，同源性都達到88.17％。
　?、谌R氏野村菌Nraox的表達分析收集萊氏野村菌微菌核發(fā)育不同時期的樣品，采用熒光定量qPCR的方法對Nraox基因的表達模式進行分析，結(jié)果表明該基因在微菌核發(fā)育的不同時期均有表達，并在微菌核形成初期表達量最高，然后降低；采用qPCR技術(shù)檢測Nraox在氧脅迫誘導(dǎo)劑處理后的基因表達，研究結(jié)果表明，氧化劑H2O2和甲萘醌都能引起該基因的高度上調(diào)表達，H2O2處理后Nraox表達量是對照組

6、的7倍，甲萘醌處理后是對照組的20倍。
　　③抑制劑處理對交替氧化酶功能的驗證采用交替氧化酶的特殊抑制劑SHAM處理后，檢測細胞內(nèi)過氧化氫含量變化，結(jié)果顯示，與對照組相比，抑制劑SHAM處理后前10min中內(nèi)細胞內(nèi)H2O2較高，處理15min后沒有明顯變化；但是，顯微觀察菌絲形態(tài)發(fā)現(xiàn)與對照組相比，處理組菌絲表現(xiàn)為彎曲和很多芽狀結(jié)構(gòu)的不正常生長狀態(tài)；而誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的微菌核表現(xiàn)為微菌核的形成延遲、微菌核顆粒直徑較大以及微菌核結(jié)構(gòu)松散、

7、表面比較蓬松。由此可以確定，抑制劑處理后減緩了細胞內(nèi)過氧化氫的清除速度，并對細胞產(chǎn)生了一定的氧毒害。
　?、躌NA干擾技術(shù)驗證Nraox基因功能利用RT-qPCR技術(shù)對不同濃度siRNA的干擾效率進行檢測，結(jié)果顯示800nMsiRNA能夠有效下調(diào)Nraox基因的表達，并且該基因表達量下調(diào)了約76.1%。與對照組相比，干擾菌株在含有脅迫誘導(dǎo)劑的固體SMAY培養(yǎng)基上生長時，菌落生長緩慢，菌落變小，產(chǎn)孢量降低。而在微菌核誘導(dǎo)培養(yǎng)基AM中

8、生長時，Nraox基因干擾后的微菌核表型發(fā)生了明顯變化，主要表現(xiàn)為：與野生菌相比，微菌核的形成推遲，微菌核顆粒的直徑變大，質(zhì)地較為疏松；微菌核的生物量和產(chǎn)量顯著性降低；顯微觀察發(fā)現(xiàn)相對于對照組，干擾后的萊氏野村菌菌絲顯示畸形生長，表現(xiàn)為菌絲上生出很多芽狀結(jié)構(gòu)；這些結(jié)果表明，Nraox參與了萊氏野村菌微菌核的形成調(diào)控。
　?、莞蓴_菌株對靶標(biāo)害蟲的致病性鑒定采用點滴法測定干擾菌株微菌核對三齡斜紋夜蛾幼蟲的侵染和致病能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾