萊氏野村菌兩型轉(zhuǎn)換的初步研究.pdf

1、近年來對(duì)以蟲生真菌為代表的生物農(nóng)藥的相關(guān)研究逐漸成為研究熱點(diǎn)。這其中就包括萊氏野村菌（Nomuraea rileyi），它能夠侵染多種鱗翅目昆蟲，特別是夜蛾科害蟲，在田間能引發(fā)害蟲的流行病，具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
　　萊氏野村菌在自然侵染和人工培養(yǎng)生長過程中呈現(xiàn)兩型生長，即前期以酵母態(tài)細(xì)胞進(jìn)行增殖，然后再轉(zhuǎn)換為菌絲，進(jìn)而產(chǎn)生分生孢子。對(duì)其兩型生長研究有助于揭示其兩型轉(zhuǎn)換機(jī)制，指導(dǎo)生產(chǎn)應(yīng)用。而且萊氏野村菌酵母型細(xì)胞可作為良好受體細(xì)胞，用

2、于遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建和基因敲除、回復(fù)和超表達(dá)。目前真菌兩型態(tài)生長研究主要集中在人類致病菌，野村菌等蟲生真菌的兩型轉(zhuǎn)換調(diào)控機(jī)理研究寥寥無幾。本研究在詳細(xì)觀察萊氏野村菌兩型轉(zhuǎn)換過程的基礎(chǔ)上，對(duì)現(xiàn)有制備萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的劃線法進(jìn)行優(yōu)化改良，獲得了酵母型孢子同步大量制備技術(shù)；利用比較轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，分析兩型轉(zhuǎn)化過程中差異表達(dá)基因，探索兩型轉(zhuǎn)換的分子調(diào)控機(jī)理，找出并驗(yàn)證兩型轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)控因素。研究為滿足萊氏野村菌遺傳轉(zhuǎn)化操作需求提供了有效方法，并

3、為野村菌兩型轉(zhuǎn)換機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。取得主要研究結(jié)果如下：
　　①優(yōu)化酵母型細(xì)胞制備方法
　　為提高酵母型細(xì)胞得率，通過單因素對(duì)制備方法進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冷藏保存3個(gè)月內(nèi)的分生孢子均可用于萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的制備。1％瓊脂濃度可以提供合適的培養(yǎng)基硬度，產(chǎn)生相對(duì)較長的酵母型細(xì)胞生長期和收獲時(shí)間窗口。接種密度、培養(yǎng)基瓊脂濃度等因素均影響到酵母型細(xì)胞的生長期、生長同步性。采取臨空播撒接種可以充分分散分生孢子，降低接種密度，形成

4、酵母型細(xì)胞菌落數(shù)量較多而且生長大體同步。
　?、谌R氏野村菌在固體培養(yǎng)基上的兩型轉(zhuǎn)換過程
　　采用優(yōu)化后的方法制備酵母細(xì)胞接種至SMAY培養(yǎng)基表面，菌落和顯微水平觀察并描述其兩型生長，確定在該實(shí)驗(yàn)環(huán)境下，12小時(shí)以內(nèi)為萊氏野村菌酵母型細(xì)胞生長階段，24-96小時(shí)為酵母型向菌絲型轉(zhuǎn)換階段，96-168小時(shí)為兩型轉(zhuǎn)換結(jié)束階段。
　　③萊氏野村菌兩型轉(zhuǎn)換過程的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
　　采用現(xiàn)代測(cè)序技術(shù)對(duì)兩型生長過程中酵母型細(xì)胞和

5、兩型轉(zhuǎn)換初期細(xì)胞進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。累計(jì)獲得了4.40 Gb核苷酸數(shù)據(jù)，拼接形成20,165個(gè)unigene序列，經(jīng)多個(gè)數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析，其中14,484個(gè)序列(71.83%)已經(jīng)被注釋。共計(jì)6,559個(gè)序列分別屬于40個(gè)基因功能大類，8,957個(gè)序列經(jīng)注釋屬于108個(gè)KEGG通路。兩個(gè)轉(zhuǎn)錄組內(nèi)共有6,048個(gè)差異表達(dá)基因，其中有2,023個(gè)差異表達(dá)基因被納入25個(gè)基因功能分類，2,931個(gè)差異表達(dá)基因經(jīng)注釋屬于108條KEGG通路，富

6、集KEGG途徑則為5條。通過重點(diǎn)分析富集KEGG途徑中上調(diào)和特異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)RIM101途徑、磷脂酰肌醇途徑等多個(gè)調(diào)控途徑和基因參與萊氏野村菌的形態(tài)轉(zhuǎn)換，并對(duì)這些基因進(jìn)行了熒光定量PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明在兩型轉(zhuǎn)換過程中，多個(gè)調(diào)控途徑和相關(guān)基因參與其中，同時(shí)細(xì)胞骨架、細(xì)胞表面成分等也出現(xiàn)了變化。所獲得基因信息為深入研究萊氏野村菌兩型轉(zhuǎn)換的分子調(diào)控機(jī)理提供了重要線索和參考依據(jù)。
　　④ pH是影響萊氏野村菌兩型轉(zhuǎn)換的重要因素
　

7、　依據(jù)比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，環(huán)境pH響應(yīng)相關(guān)RIM101途徑在萊氏野村菌兩型轉(zhuǎn)換期顯著上調(diào)表達(dá)，由此推測(cè)環(huán)境pH值是影響萊氏野村菌兩型轉(zhuǎn)換的一個(gè)重要因素，隨后采用pH梯度培養(yǎng)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。菌落和顯微觀察結(jié)果證明，在一定pH范圍內(nèi)，酸性環(huán)境可使萊氏野村菌的兩型轉(zhuǎn)換加快；在中性和堿性環(huán)境下，萊氏野村菌會(huì)在較長時(shí)間內(nèi)保持酵母型細(xì)胞生長狀態(tài)，菌絲型菌體推遲形成。
　　結(jié)論：萊氏野村菌兩型轉(zhuǎn)換受環(huán)境pH和細(xì)胞密度調(diào)控，并受到培養(yǎng)基瓊脂濃