萊氏野村菌微菌核的形態(tài)發(fā)育分子機理與液體發(fā)酵的研究.pdf

1、萊氏野村菌[ Nomuraea rileyi(Farlow) Samson]是一種環(huán)境友好的蟲生真菌，在田間自然感染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)和煙青蟲(Heliothis assulta)等多種夜蛾科害蟲，引起害蟲域內(nèi)流行病，具有潛在的應(yīng)用前景。但萊氏野村菌因產(chǎn)孢條件苛刻，導(dǎo)致生產(chǎn)成本偏高，產(chǎn)業(yè)化難度大；而普通

2、液體發(fā)酵的芽生孢子因毒力低、不耐儲存等缺陷，至今國內(nèi)外還沒有注冊登記產(chǎn)品問世，嚴(yán)重制約了萊氏野村菌的產(chǎn)業(yè)化和應(yīng)用。因此，尋找一種替代分生孢子的侵染體是十分必要的，其具有抗逆、耐貯、適合規(guī)模化生產(chǎn)的優(yōu)點。微菌核是菌絲聚集而形成特異休眠體結(jié)構(gòu)，作為多種植物病原真菌的繁殖體抵抗不良的環(huán)境。在適宜的環(huán)境下能夠萌發(fā)產(chǎn)生的菌絲和孢子可以作為有效的侵染體。重慶大學(xué)基因中心成功實現(xiàn)了萊氏野村菌微菌核液體誘導(dǎo)培養(yǎng)，然而微菌核的形態(tài)發(fā)育分子機理及批量發(fā)酵工

3、藝尚無人問津。
　　本研究在野村菌液體微菌核誘導(dǎo)形成的基礎(chǔ)上，旨在從微菌核的形成分子機理、優(yōu)化發(fā)育過程、發(fā)酵工藝優(yōu)化開展研究，以期證實微菌核能夠作為野村菌新制劑的活性成分(母藥)，探索分子發(fā)育調(diào)控機理，實現(xiàn)液體規(guī)模化發(fā)酵，進而推動野村菌的產(chǎn)品研制，促進野村菌的產(chǎn)業(yè)化。
　　取得的主要研究結(jié)果如下：
　　1）微菌核培養(yǎng)營養(yǎng)成分的優(yōu)化
　　為提高微菌核產(chǎn)量，通過單因素對微菌核的誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行優(yōu)化篩選。在此基礎(chǔ)上，選擇

4、碳源、氮源、主要微量元素對微菌核發(fā)育有促進作用的3因素和3較優(yōu)水平進行正交設(shè)計試驗[L9(3)3]。微菌核的最佳培養(yǎng)基培養(yǎng)為葡萄糖：32.0g/l；檸檬酸銨：2.0g/l；硫酸亞鐵：0.15g/l，其它離子元素也不可缺少。這三個營養(yǎng)元素對微菌核形成的影響次序為：硫酸亞鐵>葡萄糖>檸檬酸銨。因此鐵離子是影響微菌核發(fā)育的最主要營養(yǎng)因子。
　　2）萊氏野村菌微菌核發(fā)育及生物學(xué)特性分析
　　收集優(yōu)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)的微菌核，對微菌核的生

5、物學(xué)特性，包括耐熱能力、貨架期、侵染能力分別進行評估分析。結(jié)果表明微菌核具有可持續(xù)的侵染能力，并且比分生孢子具有較高的耐熱能力。在室溫放置1年后，仍具有86.4％的萌發(fā)能力。結(jié)果表明微菌核能夠替代分生孢子，作為萊氏野村菌母藥的有效成分。
　　3）比較轉(zhuǎn)錄組研究微菌核的發(fā)育分子機理
　　為研究微菌核發(fā)育分子機理，采用比較轉(zhuǎn)錄組法對微菌核發(fā)育過程中表達基因進行高通量測序。共獲得了由4.69 Gb核酸組成的32,061個序列，其中

6、20,919個序列(65%)得到注釋。在這些序列中，僅有5,928個序列注釋34個基因功能分類，有12,778個序列匹配到165條KEGG途徑。兩個轉(zhuǎn)錄組中共發(fā)現(xiàn)了4,808個差異表達基因，其中有719個差異表達基因注釋了25個基因功能分類，1,888個差異表達基因匹配了161條KEGG途徑，其中包含25條富集KEGG途徑。通過對富集KEGG中上調(diào)或者特異表達的基因進行分析，發(fā)現(xiàn)這些基因均在氧脅迫解毒方面發(fā)揮共性作用。為驗證這一發(fā)現(xiàn)，對

7、這些上調(diào)基因進行熒光定量PCR驗證。結(jié)果顯示微菌核發(fā)育過程中伴隨著氧脅迫的發(fā)生，同時一系列代謝發(fā)生著顯著變化。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為研究萊氏野村菌微菌核發(fā)育提供了大量的基因信息。
　　4）調(diào)控微菌核發(fā)育的功能基因鑒定
　　跨膜蛋白(Sho1p和Sln1p)在感受生長壓力和調(diào)節(jié)細胞應(yīng)對環(huán)境壓力方面發(fā)揮著重要的功能。我們首先檢測了微菌核發(fā)育過程中環(huán)境的變化以及對微菌核發(fā)育的影響。另一方面，我們克隆了跨膜蛋白的兩個基因(sho1和sln1)

8、，它們分別編碼了306個和1118個氨基酸序列。在應(yīng)對微菌核發(fā)育過程中變化的微環(huán)境，兩個基因表達量均上調(diào)。為確認sho1和sln1基因功能，我們通過RNA干擾技術(shù)分別構(gòu)建了RNA干擾體(單干擾體：sholRM, sln1RM和雙干擾體 shol&sln1RM)。這些干擾體對滲透壓和氧脅迫敏感，導(dǎo)致生長速度、產(chǎn)孢量和微菌核形成數(shù)量顯著下降。研究結(jié)果顯示：sho1和sln1基因在萊氏野村菌應(yīng)答生長壓力進而調(diào)控微菌核的發(fā)育方面發(fā)揮著重要功能。

9、
　　5）微菌核培養(yǎng)條件的優(yōu)化
　　選擇轉(zhuǎn)速、接種濃度、起始pH和培養(yǎng)溫度進行影響微菌核液體發(fā)酵關(guān)鍵條件篩選試驗，其中轉(zhuǎn)速、接種濃度和培養(yǎng)溫度三個因素為影響微菌核液體發(fā)酵關(guān)鍵條件的主要因素。其后對這三個主要因素采用23的中心組合和響應(yīng)面法設(shè)計試驗，獲得了影響微菌核產(chǎn)量的因素多項式，表明轉(zhuǎn)速和接種濃度是更為重要的因素。
　　6）微菌核批量發(fā)酵工藝的建立及優(yōu)化
　　利用不同類型的接種體、不同培養(yǎng)時間的接種體和不同接種