萊氏野村菌微菌核形成中NADH氧化酶基因及活性氧的功能研究.pdf

1、萊氏野村菌(Nomuraea rileyi)作為一種可侵染多種鱗翅目夜蛾科害蟲(chóng)的環(huán)境友好型蟲(chóng)生真菌,由于其在害蟲(chóng)防治方面具有重要的作用,因而受到人們的廣泛關(guān)注及重視。蟲(chóng)生真菌的分生孢子是其作為殺蟲(chóng)劑的主要有效成分,但萊氏野村菌大量產(chǎn)孢所需的生產(chǎn)條件較為苛刻,限制了該菌的規(guī)?；a(chǎn)及廣泛應(yīng)用。因此,我們課題組另辟蹊徑,成功誘導(dǎo)出了一種可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)分生孢子的侵染體結(jié)構(gòu),即一種具有抗逆性強(qiáng)、耐高溫和耐儲(chǔ)存等優(yōu)點(diǎn)的微菌核。但目前有關(guān)萊氏野村菌微

2、菌核的發(fā)育機(jī)制尚不清楚,因此本課題組進(jìn)行了萊氏野村菌微菌核的比較轉(zhuǎn)錄組分析,以從分子層面探討微菌核的發(fā)育機(jī)制,為微菌核的大量生產(chǎn)及研制高效防治夜蛾科害蟲(chóng)的生物制劑奠定基礎(chǔ)。本研究從以下兩個(gè)方面了進(jìn)行了研究:一是氧脅迫與微菌核發(fā)育之間的關(guān)系;二是在比較轉(zhuǎn)錄組分析的基礎(chǔ)上,克隆得到了一個(gè)與微菌核發(fā)育相關(guān)的基因—NADH氧化酶基因Nox,并采用RNA干擾技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了功能分析。主要研究結(jié)果如下:
　?、偻ㄟ^(guò)添加外源氧化劑(H2O2,甲萘

3、醌)和抗氧化劑(抗壞血酸)所分別造成的氧脅迫或抗氧脅迫對(duì)微菌核發(fā)育的影響,發(fā)現(xiàn)10-7、10-5M H2O2能夠顯著性地促進(jìn)微菌核的分化,提高其生物量及產(chǎn)量;且1μM甲萘醌也能顯著促進(jìn)微菌核的分化,提高其產(chǎn)量。而不同濃度的抗壞血酸均能顯著抑制微菌核的分化,尤其是當(dāng)抗壞血酸添加至0.03g/L時(shí),可完全抑制微菌核的形成。這表明,一定濃度的氧脅迫能夠促進(jìn)微菌核的分化。
　?、诎麅?nèi)H2O2含量測(cè)定表明,在微菌核形成初期(MI)時(shí),胞內(nèi)H

4、2O2含量最高,大約是未分化時(shí)期(UD)的3倍。這表明 H2O2在微菌核發(fā)育中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能,即較高濃度的活性氧參與了微菌核的分化過(guò)程。
　?、鄹鶕?jù)轉(zhuǎn)錄組上調(diào)基因庫(kù)中NADH氧化酶的EST序列,通過(guò)RACE技術(shù)獲得了Nox基因的全長(zhǎng)序列,Genbank登錄號(hào)為KF425266。Nox基因的cDNA全長(zhǎng)為1663bp,其中開(kāi)放閱讀框?yàn)?233bp,編碼410個(gè)氨基酸,基因組大小為1788bp,含有2個(gè)內(nèi)含子。生物信息學(xué)分析表

5、明,該蛋白理論分子量為44.81kDa,理論等電點(diǎn)為7.12,無(wú)信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu),定位于線粒體上,并含有一個(gè)oldyellow enzyme(OYE)-related FMN binding domain(15-356aa)。同源比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),萊氏野村菌的Nox蛋白與綠僵菌的同源性最高,約為82％;且親緣關(guān)系最近。
　　④RT-qPCR表達(dá)特性分析表明,Nox在微菌核發(fā)育的各時(shí)期均有表達(dá)。并在MI時(shí)期表達(dá)量最高,大約是U

6、D期的5.6倍;隨后降低,這與胞內(nèi)H2O2含量的變化趨勢(shì)大致相同。
　?、莶捎妹敢种苿┖蚏NA干擾技術(shù)進(jìn)行Nox基因的功能分析表明,Nox基因與微菌核的發(fā)育有關(guān)。其中采用魚(yú)藤酮抑制劑研究發(fā)現(xiàn),40μM和100μM魚(yú)藤酮均能顯著抑制微菌核的形成,且100μM魚(yú)藤酮使得Nox基因的mRNA表達(dá)量下降了約50％。
　?、尥ㄟ^(guò)RT-qPCR檢測(cè)干擾效率表明,500nM siRNA能夠有效沉默Nox基因的表達(dá),使其mRNA表達(dá)量下調(diào)了

7、約57％。觀察干擾Nox基因后微菌核的表型,發(fā)現(xiàn)500nM siRNA干擾菌株所產(chǎn)生的微菌核表型發(fā)生了明顯變化,主要表現(xiàn)為:微菌核顆粒的直徑變大、培養(yǎng)液中紫褐色色素消失、菌液黏稠度下降以及微菌核產(chǎn)量顯著性降低,其產(chǎn)量下降了約98.5％。這些結(jié)果表明,Nox參與調(diào)控萊氏野村菌微菌核的發(fā)育。
　?、逳ox基因與胞內(nèi)H2O2的產(chǎn)生有關(guān)。500nM siRNA干擾菌株所產(chǎn)生的微菌核胞內(nèi)H2O2含量下降了約38％。結(jié)合上述研究結(jié)果,我們初步