鼠李糖乳桿菌NADH氧化酶的性質(zhì)與結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、NADH氧化酶（簡稱Nox，EC1.6.99.3)是指能利用空氣中的氧氣催化NADH氧化的氧化還原酶類。NADH氧化酶廣泛存在于各種微生物體內(nèi)，并且在調(diào)控微生物代謝方面有重要作用。另外，它可以以相對低耗能的代價催化氧化再生輔酶NAD+，因此表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛能。本課題從Lactobacillusrhamnosus中克隆出編碼NADH氧化酶的基因，分析了NADH氧化酶的性質(zhì)，另外通過定點突變對目的蛋白進行結(jié)構(gòu)改造。本課題主要研究內(nèi)容有：<

2、br>　　（1）抽提Lactobacillus rhamnosus ATCC53103基因組DNA，通過PCR技術(shù)克隆出3段編碼NADH氧化酶基因，分別為Nox(447)（Gene ID:8420447），Nox(552)（Gene ID:8420552）以及Nox(603)（Gene ID:8420603）。將目的片段連接到表達載體pET-28a上，再轉(zhuǎn)化到Escherichia Coli BL21中表達。
　?。?）對Nox(

3、447)進行了表達純化和性質(zhì)表征。Nox(447)表達的最佳溫度是15 oC，最佳時間是4小時，最佳誘導劑濃度是1.25 mM。最適FAD輔酶濃度為20μM，后來隨著其濃度的增加開始出現(xiàn)抑制酶活性現(xiàn)象。Nox(447)催化最佳pH為5.6，在pH值達到10時沒有活力。酶的最佳催化溫度為45 oC，且保溫160分鐘后酶活性沒有明顯降低；50 oC時，半衰期為3小時，而55 oC時，酶在1小時后完全失活，說明該酶在高溫情況下不穩(wěn)定。通過雙倒

4、數(shù)曲線計算動力學參數(shù)，最終得到最大催化速率（Vmax）為1.21 mM/min，Km值345.47μM。
　?。?）Nox(447)氨基酸序列中并沒有半胱氨酸作為催化中心，利用分子對接分析結(jié)果顯示，NADH與酶的HIS319，GLY298以及TYR341這三個殘基通過形成氫鍵相互結(jié)合。通過定點突變發(fā)現(xiàn)，這三個氨基酸殘基任何一個突變?yōu)锳LA則幾乎喪失全部活力，表明這三個氨基酸殘基構(gòu)成了該酶的催化中心。
　?。?）克隆出的Nox

5、(603)為研究對象，通過定點突變來對目的蛋白進行結(jié)構(gòu)改造，以得到性質(zhì)更優(yōu)，應(yīng)用更廣的NADH氧化酶。根據(jù)對該酶的結(jié)構(gòu)特點進行分析，篩選出8個位點（Q18，A85，A218，A184，N186，N227，T346，S146）突變成極性半胱氨酸。圓二色譜分析突變體酶的二級結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生明顯變化，并且比活力最多提高了59.04％。動力學實驗數(shù)據(jù)顯示，突變體酶的Km值相比于原始酶降低了3.67-43.11%，最大催化速率相對提高了1.73-48

6、.19%。說明突變體酶相比于原始酶有更好的底物親和力以及催化速率。實驗數(shù)據(jù)表明，突變后的Cys并未與酶活性中心的Cys形成穩(wěn)定的二硫鍵而導致酶失去催化活性，并且在酶的動力學實驗方面也表現(xiàn)出優(yōu)勢。
　　5）利用MOE軟件對酶和底物NADH進行分子對接。通過打分函數(shù)對分子對接的結(jié)果進行打分，顯示突變體酶的打分值相比于突變前降低了12.37~70.32%，說明基因改造后的NADH氧化酶的構(gòu)象更易與輔酶以及底物結(jié)合，該結(jié)果與動力學實驗得到