鼠李糖乳桿菌L3-22株的選育和培養(yǎng)條件優(yōu)化及免疫功能的研究.pdf

1、本文在篩選出鼠李糖乳桿菌L3-22(LRL3-22)株的基礎(chǔ)上，對(duì)其培養(yǎng)條件、活性物質(zhì)、代謝產(chǎn)物的抑菌活性、細(xì)胞破碎方法及小鼠免疫功能進(jìn)行了研究，為該菌微生態(tài)制劑的研制開發(fā)奠定基礎(chǔ)。用牛津杯雙層平板定量擴(kuò)散法、酸度計(jì)測(cè)培養(yǎng)物pH值法及菌體干重法，對(duì)9種13株乳酸菌抑菌活性、抑菌范圍、產(chǎn)酸能力及生長速度進(jìn)行測(cè)定；用紫外線照射進(jìn)行誘變，篩選正向突變菌株。采用測(cè)定LRL3-22株培養(yǎng)物的生物量及酸度的方法，對(duì)培養(yǎng)基的成分和起始pH值、培養(yǎng)溫度

2、、時(shí)間、方式及接種量進(jìn)行優(yōu)化，并繪制發(fā)酵增殖曲線。用牛津杯雙層平板定量擴(kuò)散法對(duì)LRL3-22株代謝產(chǎn)物進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)。通過測(cè)定破碎液的A<,600>、A<,280>、A<,260>nm值來反映細(xì)胞的破碎程度和胞內(nèi)蛋白及核酸物質(zhì)的釋放情況來比較超聲波破碎法、反復(fù)凍融法及高速勻漿法的細(xì)胞破碎效果及優(yōu)缺點(diǎn)。用最小二乘法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得出LRL3-22株培養(yǎng)物的乳酸和肽聚糖產(chǎn)量；用試管稀釋法測(cè)出LRL3-22株代謝產(chǎn)物的最小抑菌稀釋度(MIC)

3、和最小殺菌稀釋度(MBC)。 用健康小鼠80只作為試驗(yàn)動(dòng)物，對(duì)照組為滅菌水。試驗(yàn)1組為自制發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48h；試驗(yàn)2組為LRL3-22株37℃、48h培養(yǎng)物，活菌數(shù)為4.19×10<'8>個(gè)／mL；試驗(yàn)3組為100℃滅活30min的LRL3-22株培養(yǎng)物。所有試驗(yàn)小鼠均采用經(jīng)口接種，0.5mL／只／d，連續(xù)13d。通過測(cè)定小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬活性和T淋巴細(xì)胞數(shù)量及抗體、血清溶血素、器官指數(shù)的變化，研究LRL3-22株培養(yǎng)

4、物對(duì)小鼠免疫功能的影響。試驗(yàn)得出以下結(jié)果： 1.從9種13株乳酸菌中篩選出一株抑菌活性高、抑菌范圍廣、產(chǎn)酸能力強(qiáng)及生長速度快的乳酸菌，即鼠李糖乳桿菌L3株。通過紫外線照射其誘變，最終獲得一株抑菌活性比出發(fā)菌提高11.74％，且活性穩(wěn)定的LRL3-22株。 2.LRL3-22株發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化組合是：14％麥芽汁+3％豆餅汁(1:5)，添加適量的復(fù)合無機(jī)鹽成分；優(yōu)化的培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)基pH自然，26～37℃靜止培養(yǎng)48

5、h，接種量2％；發(fā)酵增殖曲線呈近“S”形，生物量與產(chǎn)酸量正相關(guān)，培養(yǎng)36h時(shí)，生物量達(dá)最大值1.409；36h時(shí)，pH值最低3.79。 3.超聲波破碎法的最佳功率是500W，lO～30min的破碎效果沒有明顯變化；反復(fù)凍融法的最佳次數(shù)是5次；高速勻漿法的最佳量程為8×2800；以反復(fù)凍融法簡單易行，效果也比較理想。 4.LRL3-22株代謝產(chǎn)物有較強(qiáng)的抑菌活性。該活性熱穩(wěn)定性好，能耐受100C<’。>的溫度，不受過氧

6、化氫酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的影響；但受pH值的影響較大，隨著pH值的升高抑菌活性逐漸降低，在弱酸、中性和堿性條件下將失去抑菌活性。 5.LRL3-22株培養(yǎng)物的乳酸產(chǎn)量為0.159g／mL，肽聚糖含量為0.01mg／mL,葡萄糖胺含量為0.0003 mg／mL；經(jīng)破碎后的LRL3-22株培養(yǎng)物的乳酸產(chǎn)量為0.159g／mL，肽聚糖含量為0.51 mg／mL，葡萄糖胺含量為0.0076 mg／mL；LRL3-22株培養(yǎng)

7、48h，其培養(yǎng)物的MIC為0.0625 mg／mL，MBC為0.125 mg／ml；培養(yǎng)72h，MIC為0.03125 mg／ml，MBC為0.0625 mg／mL。 6.LRL3-22株培養(yǎng)物能激活小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬活性，明顯促進(jìn)其吞噬作用；可使T淋巴細(xì)胞數(shù)量比對(duì)照組多4.28％，抗體積數(shù)比對(duì)照組多45.1％，并能提高小鼠血清IgM水平及胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。 本研究篩選出了一株有益乳桿菌，即鼠李糖乳桿菌L3-2