吡非尼酮通過NADPH氧化酶調(diào)節(jié)活性氧簇在大鼠肝纖維化中的研究.pdf

1、研究背景：肝纖維化是慢性肝損傷后組織進行的自我修復(fù)反應(yīng)，由多種致病因素引起，其持續(xù)進展的最終結(jié)局為肝硬化，甚至肝癌。肝纖維化的中心環(huán)節(jié)為肝星狀細胞（Hepatic stellate cell，HSC）的活化。研究發(fā)現(xiàn)，在肝纖維化時，由NADPH氧化酶（NADPH oxidase，NOX）介導(dǎo)所產(chǎn)生的活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）除了能夠直接活化HSC外，還可以介導(dǎo)多種促肝纖維化因子在細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

2、因此，通過調(diào)節(jié)該酶的活性和表達，以降低ROS的產(chǎn)生，從而對各種細胞因子在HSC內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生作用，可能是肝纖維化阻止或者逆轉(zhuǎn)的新靶點。吡非尼酮（pirfenidone，PFD）是近年來備受關(guān)注的一個具有廣譜抗纖維化作用的藥物，研究發(fā)現(xiàn)PFD可通過多種途徑抑制HSC的活化和增殖，進而發(fā)揮抗肝纖維化的作用，然而PFD是否通過影響 NOX調(diào)節(jié)ROS的表達，從而發(fā)揮其抗肝纖維化的作用尚不清楚。本研究分為以下兩個部分：
　　第一部分

3、>　　目的：探討PFD對CCl4所致肝纖維化大鼠模型中NOX表達的影響及其抗氧化機制。方法：50只SD大鼠，雌雄各半，隨機分為對照組、模型組、PFD低高劑量組（200mg/kg/d，400mg/kg/d）以及陽性對照組（夾竹桃麻素，Apocynin，APO，20mg/kg/d），每組10只，模型組及各藥物組大鼠腹腔注射50％CCl4橄欖油溶液，劑量為1ml/kg，對照組腹腔注射等量的橄欖油，每周兩次，連續(xù)八周。第六周開始灌胃給予PFD和

4、陽性藥物APO，連續(xù)21天。末次給藥24h后處死大鼠，收集血清和肝組織，檢測血清ALT、AST；HE染色觀察肝組織病理學(xué)變化；檢測肝組織中羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）、MDA及SOD的變化；Western-blotting法檢測肝組織NOX1、NOX4蛋白的表達。結(jié)果：1）與對照組相比，模型組大鼠體重明顯降低（P<0.05），肝指數(shù)明顯增加（P<0.01），血清AST、ALT顯著增加（P<0.01），Hyp含量顯著增

5、加（P<0.01），肝組織MDA含量顯著上升（P<0.01），SOD活性下降（P<0.05）。經(jīng)PFD和APO干預(yù)后，與模型組比較，藥物組肝指數(shù)顯著降低（P<0.05），血清AST、ALT明顯降低（P<0.05），肝組織Hyp含量下降（P<0.05，P<0.01），MDA下降（P<0.05），SOD上升（P<0.05）。2）HE染色結(jié)果病理學(xué)顯示，對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，無纖維化增生；模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)明顯破壞，纖維增生，形成假小葉

6、；藥物組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)輕度紊亂，無明顯假小葉形成。3）Western-blotting結(jié)果表明，模型組NOX1、NOX4蛋白表達與對照組比較顯著上調(diào)（P<0.01）；藥物干預(yù)組 NOX1、NOX4蛋白表達較模型組顯著下調(diào)（P<0.01）。
　　第二部分
　　目的：探討PFD對血管緊張素II（Angiotensin II，Ang II）誘導(dǎo)大鼠肝星狀細胞（HSC-T6）ROS產(chǎn)生的影響及其相關(guān)機制。方法:取對數(shù)生長期的HSC-

7、T6細胞，分為以下六組：對照組、Ang II組、PFD低、中、高劑量組（0.2mM，0.4mM，0.8mM）和陽性對照組（APO，20μM）。分別用PFD和APO預(yù)處理HSC-T630min后，除對照組外，其他各組加入1μM Ang II刺激。經(jīng)藥物作用24h后，采用2',7'-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)探針法檢測ROS的生成，Western-blotting檢測細胞內(nèi)NOX1、NOX4蛋白表達。結(jié)果：Ang II組細胞內(nèi)RO

8、S的生成顯著高于對照組（P<0.01），PFD低、中、高劑量組（0.2mM，0.4mM，0.8mM）和陽性對照組的ROS的生成均低于Ang II組（P<0.05，P<0.01）且PFD作用呈劑量依賴性。Western-blotting結(jié)果顯示，Ang II能顯著增加HSC-T6細胞中NOX1、NOX4蛋白的表達（P<0.01），PFD和APO干預(yù)后，其蛋白表達明顯下調(diào)（P<0.05，P<0.01）。
　　結(jié)論：1）PFD對CCl4