氟非尼酮對腎纖維化炎癥反應的影響.pdf

1、第一章氟非尼酮對腎纖維化炎癥反應的影響
　　 研究背景：腎纖維化是各種腎臟疾病進展到終末期腎衰竭的共同途徑和主要病理基礎，其病變程度與慢性腎臟病的預后密切相關，如何防治腎間質纖維化成為目前腎臟病領域的研究熱點之一。目前臨床上針對抑制腎臟纖維化過程的藥物很少，尚缺乏真正有效用于臨床治療的藥物。氟非尼酮是本研究組合成得到的一種新的吡啶酮類化合物，已獲得國家發(fā)明專利。在前期的研究中發(fā)現(xiàn)AKF-PD可抑制成纖維細胞增殖；對單側輸尿管結扎

2、模型大鼠腎臟病變有顯著療效。AKF-PD抗腎纖維化作用的機制尚處于研究之中，目前的研究結果顯示AKF-PD能抑制NADPH氧化酶的表達和減少活性氧的產生，抑制腎小管細胞凋亡、轉分化及成纖維細胞的增殖，下調致纖維化細胞因子的表達，減少病變腎臟基質膠原合成。尚未觀察AKF-PD對腎纖維化早期炎癥反應的影響。炎癥反應作為腎臟纖維化的始動環(huán)節(jié)之一，具有非常重要的作用，此時腎單位損傷相對較少，且并無大量肌成纖維細胞的過度增殖，經過有效的修復，可以

3、使受損的細胞恢復自主調節(jié)功能，阻止腎病的繼續(xù)進展。目前國內外學者對腎纖維化炎癥反應達成以下共識：(1)炎癥反應是腎臟在各種損傷刺激下發(fā)生的早期事件，腎臟炎癥反應的遷延持續(xù)，最終促使腎纖維化的形成；(2)炎癥細胞浸潤在腎臟的慢性炎癥和纖維化過程中發(fā)揮重要作用；(3)趨化因子及炎癥因子是腎纖維化形成過程中炎癥細胞浸潤和慢性炎癥持續(xù)存在的關鍵因素。
　　 針對腎纖維化的發(fā)病環(huán)節(jié)，國內外學者開展了大量抗腎纖維化藥物的研究工作，其中PFD

4、是新型的廣譜抗纖維化復合物，能夠防止甚止逆轉腎纖維化發(fā)生，但其抗腎纖維化作用機制也處于研究之中，對腎纖維化早期炎癥反應的影響尚未有文獻報道；血管緊張素Ⅱ參與促進腎臟損傷后炎癥細胞浸潤，有報道血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)及血管緊張素受體拮抗劑(ARB)可減輕病變腎組織炎癥反應。
　　 目的：觀察AKF-PD對UUO大鼠腎臟組織炎癥細胞浸潤及趨化因子、炎癥因子表達的影響；探討AKF-PD對腎纖維化炎癥反應的影響，從而進一步了解

5、AKF-PD抗腎纖維化的機制。
　　 方法：以單側輸尿管結扎方法建立腎纖維化模型。SD大鼠（75只）隨機分為假手術組、UUO模型組、AKF-PD治療組、吡非尼酮治療組、氯沙坦治療組；分別于UUO術后3天、7天、14天留取各組大鼠梗阻側腎臟標本：14天各組腎臟標本分別行HE和MASSON染色觀察大鼠腎纖維化成模情況及藥物療效；3天、7天各組腎臟標本分別制備石蠟切片行CD68、CD3標記的炎癥細胞免疫組織化學染色，提取總RNA行re

6、al-time PCR檢測趨化因子(MCP-1，RANTES，IP-10，MIP-1α，MIP-1β)和炎癥因子(TNF-α，IL-1β)mRNA表達水平，提取總蛋白以ELISA方法檢測上述趨化因子和炎癥因子蛋白表達水平。
　　 結果：(1)HE和MASSON染色結果顯示UUO術后14天模型組大鼠腎組織可見明顯間質纖維化病理改變及大量藍染的膠原纖維，腎間質損傷指數和腎間質膠原相對面積評分較假手術組明顯上升，造模成功；與模型組比較

7、，AKF-PD治療組、PFD治療組及氯沙坦治療組腎組織間質纖維化程度減輕，藍染的膠原纖維減少，腎間質損傷指數和腎間質膠原相對面積評分顯著下降(P＜0.05)；三種藥物作用效果相似。
　　 (2)免疫組織化學染色結果顯示UUO術后3天模型組可見巨噬細胞及淋巴細胞的浸潤，術后7天浸潤的巨噬細胞及淋巴細胞增多；AKF-PD、PFD及氯沙坦均能有效抑制UUO術后3天、7天病變腎臟巨噬細胞和淋巴細胞的浸潤(P＜0.05)。
　　

8、(3)UUO術后3天模型組各趨化因子及炎癥因子mRNA和蛋白表達水平明顯升高；AKF-PD治療組、PFD治療組及氯沙坦治療組各趨化因子及炎癥因子mRNA和蛋白表達水平較模型組顯著下降(P＜0.01)。且三種藥物的作用相似。
　　 UUO術后7天模型組與UUO術后3天模型組比較，趨化因子及炎癥因子的表達下降；藥物對趨化因子及炎癥因子的表達的影響有所不同：在mRNA水平，IP-10和MIP-1β組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)：

9、AKF-PD治療組RANTES、MCP-1、MIP-1α、TNF-α較模型組顯著下降(P＜0.05)；PFD治療組MCP-1、MIP-1α較模型組顯著下降(P＜0.05)；氯沙坦治療組MCP-1較模型組顯著下降(P＜0.05)，三種藥物對IL-1β作用均不明顯（與模型組比較P＞0.05）。在蛋白水平，AKF-PD治療組、PFD治療組所有趨化因子及炎癥因子較模型組顯著下降(P＜0.05)；氯沙坦治療組RANTES、MCP-1、IP-10、

10、MIP-1α較模型組顯著下降(P＜0.05)。
　　 結論：(1)AKF-PD具有抗腎間質纖維化的作用。
　　 (2)AKF-PD能下調病變腎臟組織趨化因子及炎癥因子的表達，從而抑制了炎癥細胞的浸潤，有效減輕病變腎臟的炎癥反應；提示這可能是其抗腎纖維化作用的重要機制之一。
　　 (3)AKF-PD、PFD及氯沙坦減輕病變腎臟的炎癥反應的作用相似，但對UUO術后7天大鼠腎組織各種趨化因子及炎癥因子的表達的影響有所不

11、同。
　　 第二章氟非尼酮對內毒素血癥小鼠死亡率及炎癥因子的影響
　　 研究背景：氟非尼酮(AKF-PD)是本研究組合成得到的一種新的吡啶酮類化合物，具有較強的抗腎纖維化作用。目前AKF-PD抗纖維化的機制還不十分確切，前面的研究結果顯示AKF-PD能夠下調UUO模型大鼠病變腎臟趨化因子及炎癥因子的表達，抑制炎癥細胞的浸潤，提示抑制炎癥反應是其抗腎纖維化作用的重要途徑之一。腎纖維化中的炎癥反應是腎臟組織在各種損傷刺激下，

12、以單核/巨噬細胞系統(tǒng)激活及炎癥介質釋放為主的緩慢發(fā)生、持續(xù)存在的局部炎癥反應，有別于由感染引起的全身炎癥反應綜合癥，即膿毒血癥(sepsis)。膿毒血癥的本質是致病原激活炎癥相關轉錄因子，大量下游炎癥介質基因過度表達，炎癥免疫失控和免疫紊亂。AKF-PD對其影響尚不清楚。
　　 當微生物入侵人體，機體免疫防御系統(tǒng)會作出迅速而恰當的反應；免疫防御能力缺陷、反應過高或過低，都可導致膿毒血癥的發(fā)生和發(fā)展。臨床膿毒血癥患者最常見的是革蘭

13、陰性(G-)菌感染。革蘭陰性菌內毒素，即脂多糖(LPS)在啟動體內免疫系統(tǒng)反應，導致中毒性休克中的重要性已得到普遍認識。LPS介導單核巨噬細胞激活，合成和釋放各種炎癥因子（如TNF-a和IL-1β），這些炎癥因子能促進中性粒細胞與內皮細胞粘附，激活凝血系統(tǒng)，引起全身炎癥反應綜合征，嚴重者導致休克、多器官功能衰竭和死亡。
　　 炎癥反應是損傷與抗損傷的統(tǒng)一過程，現(xiàn)已知機體在啟動炎癥反應的同時，抗炎癥反應也同時發(fā)生，產生抗炎性介質等

14、。IL-10是具有抗炎和抑制機體免疫力雙重屬性的細胞因子，一方面抑制炎性細胞（如單核細胞、淋巴細胞等）的粘附、浸潤，另一方面抑制各種促炎性細胞因子的合成與分泌，有助于減輕炎癥反應。
　　 由于操作的方便性，目前常以腹腔注射LPS建立的內毒素血癥動物模型來研究膿毒血癥的發(fā)生發(fā)展及其機制，尤其是在藥物對膿毒血癥的干預與治療方面。
　　 目的：觀察AKF-PD對內毒素血癥模型小鼠死亡率的影響，探討AKF-PD對內毒素血癥機體的

15、保護作用；在體內外水平觀察AKF-PD對內毒素血癥中促炎因子(TNF-a、IL-1β)及抗炎因子(IL-10)的影響，了解AKF-PD對內毒素血癥影響的機制。
　　 方法：以LPS(15mg/kg)腹腔注射建立小鼠內毒素血癥模型。Balb/c小鼠（120只）隨機分為LPS模型組、AKF-PD（100mg/kg)治療組、AKF-PD(200mg/kg)治療組；AKF-PD治療組采用兩種方式給藥：AKF-PD和LPS同時腹腔注射或L

16、PS注射2小時后再予以AKF-PD腹腔注射。記錄各組小鼠第1-7天存活只數。
　　 根據上述實驗結果，Balb/c小鼠（30只）隨機分為LPS模型組、AKF-PD(200mg/kg)治療組，于2h、4h、8h后摘眼球取血（每個時間點每組5只），4℃離心取上清，ELISA方法檢測血清中TNF-α和IL-1β濃度。
　　 獲得原代巨噬細胞，設立正常對照組(N)，LPS模型組(LPS)、AKF-PD(400μg/ml)組、AK

17、F-PD(600μg/ml)組及AKF-PD(800μg/ml)組，24小時后ELISA方法檢測各組細胞上清TNF-α、IL-1β和IL-10濃度；根據實驗結果，設立LPS模型組和AKF-PD(800μg/ml)組，分別于不同時間點）3、6、12、16、24小時）收集細胞上清，ELISA方法檢測各組TNF-α和IL-1β濃度。
　　 結果：在AKF-PD和LPS同時腹腔注射實驗及LPS注射后2小時再予以AKF-PD腹腔注射實驗中

18、，AKF-PD(200mg/kg)均能降低內毒素血癥模型小鼠的死亡率(P＜0.05)，AKF-PD(100mg/kg)對內毒素血癥模型小鼠的死亡率無明顯影響(P＞0.05)；AKF-PD在體內外均可抑制炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達釋放(P＜0.05)，并且呈劑量和時間依賴性；但對抗炎因子IL-10的作用不明顯(P＞0.05)。
　　 結論：AKF-PD在體內外均可抑制促炎因子TNF-α和IL-1β的釋放，降低內毒素血癥模