氟非尼酮治療糖尿病腎病db-db小鼠腎纖維化及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、糖尿病腎病(DN)是糖尿病的常見嚴(yán)重并發(fā)癥之一，常發(fā)展成為終末期腎病(ESRD)。目前，臨床治療手段主要是控制血糖和抗高血壓，但療效有限，只能減慢糖尿病腎病向腎功能衰竭的進(jìn)程。因此，必須針對糖尿病腎病的主要病理機(jī)制研發(fā)新的治療藥物。糖尿病腎病組織學(xué)損傷的主要特征是膠原、纖維連接蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分在腎小球系膜和腎小管間質(zhì)進(jìn)行性沉積，最終導(dǎo)致不可逆的腎纖維化。近年來，不少研究著力于尋找能有效抑制ECM在組織中沉積而治療糖尿病腎病

2、的藥物，取得了一些前景誘人的成果。AKF-PD是一種新合成的低分子量化合物。我們研究組最近報道，在體外培養(yǎng)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞和大鼠腎小管上皮細(xì)胞中，AKF-PD能夠抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）刺激后引起的ECM的產(chǎn)生。
　　 目的：
　　 以糖尿病腎病db/db小鼠和MES13腎小球系膜細(xì)胞為實驗對象，觀察AKF-PD對腎纖維化的治療效果，并深入揭示

3、其作用機(jī)制，為研發(fā)治療糖尿病腎病的抗纖維化新藥提供實驗證據(jù)。
　　 方法：
　　 1.10周齡雄性db/db小鼠分為1個不給藥模型組和3個AKF-PD給藥組（劑量分別為每日125、500、1000mg/kg體重）;相同周齡雄性db/m小鼠作為正常對照組。稱體重和測血糖后，AKF-PD溶于羧甲基纖維素鈉溶液作灌胃給藥，不給藥db/db組和db/m組小鼠作等量羧甲基纖維素鈉溶液灌胃，各組小鼠每天灌胃一次，持續(xù)12周。實驗期間

4、2周一次測血糖水平。實驗12周后，小鼠分單只置于代謝籠，收集24h尿標(biāo)本。用ELISA法測定尿白蛋白濃度。處死各組小鼠。稱體重后，取雙側(cè)腎臟，稱腎重和剪取腎皮質(zhì)。制備腎皮質(zhì)組織切片，作PAS染色。光鏡下觀察組織切片，按每只小鼠20個腎小球，分5級（0～4級）進(jìn)行每個腎小球損傷程度的評分，并計算腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)展指數(shù)(GMI)。用ELISA法測定腎皮質(zhì)組織勻漿TGF-β1蛋白水平。以β-actin為內(nèi)參作標(biāo)化，real-time PCR方

5、法檢測腎皮質(zhì)組織Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白(FN)、金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA) mRNA的相對豐度。用腎皮質(zhì)組織裂解產(chǎn)物作SDS-PAGE，進(jìn)行western blot檢測。以α-tublin為內(nèi)參標(biāo)化，檢測TIMP-1、α-SMA蛋白質(zhì)的相對含量。
　　 2.細(xì)胞周期同步化處理的小鼠腎小球系膜細(xì)胞系（MES-13）細(xì)胞分為6個組:(1)NG組(正常濃度葡萄糖，～5.6 m

6、mol/L);(2) HG組（高濃度葡萄糖，25 mmol/L）;(3) AKF-PD組(HG+400μg/mLAKF-PD);(4) PFD組（HG+400μg/mL吡非尼酮）;(5) Los組(HG+2μmol/L氯沙坦);(6) OC組（滲透壓對照組，NG+19.4mmol/L甘露醇）。各組細(xì)胞培養(yǎng)72h后，收集細(xì)胞和上清。用ELISA法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液的TGF-β1蛋白水平。以β-actin為內(nèi)參，real-timePCR方法

7、檢測細(xì)胞Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原、TIMP-1、α-SMA mRNA的相對豐度。用細(xì)胞裂解產(chǎn)物作SDS-PAGE，進(jìn)行western blot檢測。以α-tublin為內(nèi)參，檢測TIMP-1、α-SMA蛋白質(zhì)的相對含量。
　　 結(jié)果：
　　 db/db組小鼠的腎重明顯大于db/m組小鼠(P＜0.05)。與不給藥組相比，AKF-PD給藥組db/db小鼠的腎重明顯減輕(P＜0.05)，以500mg/kg劑量組效果最明顯(P＜0.0

8、1)。
　　 db/db小鼠有嚴(yán)重的白蛋白尿，24h尿白蛋白排泄量達(dá)240.26±76.24μg，比db/m小鼠組升高8倍(P＜0.01)。AKF-PD給藥顯著減輕db/db小鼠的白蛋白尿(P＜0.01)，最大有效劑量為500mg/kg，可使24h尿白蛋白排泄量下降58.5％。
　　 從實驗開始至實驗結(jié)束，db/db小鼠始終有嚴(yán)重的高血糖，血糖一般維持于30mmol/L以上。AKF-PD給藥組與不給藥組db/db小鼠的血

9、糖水平差異無顯著性意義。
　　 與db/m小鼠相比，db/db小鼠的腎小球系膜基質(zhì)PAS陽性染色區(qū)明顯擴(kuò)大，腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)展指數(shù)(GMI)顯著增加(P＜0.01)。與不給藥組db/db小鼠比，AKF-PD給藥組db/db小鼠的腎小球系膜基質(zhì)PAS陽性染色區(qū)明顯縮小，GMI顯著減低(P＜0.05)，其中，500mg/kg體重劑量組的GMI值減低約55.8％(P＜0.01)。
　　 db/db小鼠腎皮質(zhì)的Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原

10、和纖維連接蛋白的mRNA表達(dá)水平比db/m小鼠顯著升高(P＜0.01)。AKF-PD顯著抑制三種細(xì)胞外基質(zhì)成分mRNA的表達(dá)(P＜0.05)。
　　 db/db小鼠腎皮質(zhì)的TGF-β1 mRNA和蛋白表達(dá)水平比db/m小鼠顯著升高(P＜0.01)。AKF-PD顯著抑制db/db小鼠腎皮質(zhì)TGF-β1的表達(dá)(P＜0.05)。
　　 db/db小鼠腎皮質(zhì)TIMP-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于db/m小鼠(P＜0.01)

11、。AKF-PD給藥對db/db小鼠腎皮質(zhì)TIMP-1的高表達(dá)具有顯著下調(diào)作用(P＜0.01)。
　　 db/db小鼠腎皮質(zhì)α-SMA mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著高于db/m小鼠(P＜0.01)。AKF-PD給藥明顯抑制db/db小鼠腎皮質(zhì)α-SMA的表達(dá)(P＜0.05)，其最大有效劑量為500mg/kg。
　　 與NG組相比，HG組MES-13細(xì)胞的Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原mRNA表達(dá)水平顯著增高(P＜0.01)。與HG組相

12、比，AKF-PD組、PFD組與氯沙坦組MES-13細(xì)胞的Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原mRNA表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)。且三種藥物的作用相似。
　　 與NG組相比，HG組MES-13細(xì)胞的TGF-β1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P＜0.01);與HG組相比，AKF-PD組、PFD組與氯沙坦組MES-13細(xì)胞的TGF-β1 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)。而AKF-PD與PFD能使TGF-β1蛋白表達(dá)下調(diào)到接近N

13、G組的水平，氯沙坦的這種作用較弱。
　　 與NG組相比，HG組MES-13細(xì)胞的TIMP-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P＜0.01);與HG組相比，AKF-PD組、PFD組與氯沙坦組MES-13細(xì)胞的TIMP-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01)。且三種藥物的作用相似。
　　 與NG組相比，HG組MES-13細(xì)胞的α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著增高(P＜0.01);與HG組相比，AKF-PD組、PFD組

14、與氯沙坦組MES-13細(xì)胞的α-SMA蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)。且三種藥物的作用相似。
　　 結(jié)論：
　　 AKF-PD長期給藥對db/db小鼠的糖尿病腎病有治療作用，可顯著減少糖尿病腎病db/db小鼠24小時尿白蛋白排泄量，減輕腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)展，抑制腎組織Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分及TGF-β1、α-SMA、TIMP-1的表達(dá)。AKF-PD對db/db小鼠的高血糖無明顯影響。