根皮苷對db-db小鼠主動脈的保護(hù)作用機(jī)制研究.pdf

1、第一部分根皮苷對db/db小鼠主動脈的保護(hù)作用
　　 研究背景:
　　 糖尿病以慢性血糖水平增高為特征，是一種由于胰島素抵抗伴有相對胰島素不足或胰島素分泌缺陷而導(dǎo)致的代謝性疾病。糖尿病臨床分型主要包括1型和2型糖尿病。其中，2型糖尿病患病率最高，發(fā)病機(jī)制最為復(fù)雜。過去的20年，隨著人們生活水平的提高、生活方式的改變以及人口的老齡化，2型糖尿病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)逐年增加。目前我國已成為糖尿病第一大國。糖尿病威脅人們健康與

2、生命，嚴(yán)重影響人類的生活質(zhì)量，已經(jīng)成為世界性公共衛(wèi)生問題。長期的高血糖可使一些組織或器官發(fā)生結(jié)構(gòu)改變和功能障礙，導(dǎo)致各種并發(fā)癥的產(chǎn)生。糖尿病血管病變是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，是糖尿病致死和致殘的首要原因。其中大血管病變表現(xiàn)為主動脈、冠狀動脈、腦基底動脈等大、中型血管的動脈粥樣硬化，這些血管的損害是糖尿病心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)。糖尿病患者的動脈粥樣硬化相對非糖尿病患者患病率高，發(fā)病年齡早，病情進(jìn)展快。幾乎超過半數(shù)的2型糖尿病患者最終會并發(fā)

3、糖尿病的大血管病變。但是迄今為止，針對糖尿病大血管病變的防治手段仍然集中于代謝危險因素的控制（如嚴(yán)格控制血糖、血脂、血壓），戒煙，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑的應(yīng)用等。然而上述治療方法并不能完全阻斷動脈粥樣硬化的發(fā)展。因此，深刻理解2型糖尿病及其血管并發(fā)癥的病理生理，開發(fā)研制新型藥物，在積極控制血糖的同時，關(guān)注并加強(qiáng)對其血管并發(fā)癥的干預(yù)和治療有著極為重要的意義。
　　 根皮苷是一種天然酚類物質(zhì)，可由蘋果樹的根、皮、莖、嫩葉及果實中提取

4、獲得。研究資料表明，蘋果樹體內(nèi)酚類物質(zhì)總含量中，根皮苷占到95％。根皮苷具有多種潛在的功效，包括降血糖，抗氧化，抗衰老，抗腫瘤等。根皮苷抑制內(nèi)皮粘附分子和血小板激活，對血管內(nèi)皮有保護(hù)作用。然而，根皮苷對糖尿病的大血管是否有保護(hù)作用，目前國內(nèi)外尚未見報道。本實驗以db/db小鼠作為2型糖尿病動物模型，給予根皮苷干預(yù)，觀察根皮苷對2型糖尿病大血管并發(fā)癥的影響，討論可能的作用機(jī)制，以探索根皮苷治療糖尿病的可能性，為臨床治療糖尿病大血管并發(fā)癥提

5、供新的思路和途徑。
　　 研究目的:
　　 1.觀察db/db小鼠主動脈組織病理學(xué)變化和超微結(jié)構(gòu)變化，以及根皮苷對db/db小鼠主動脈損害的影響。
　　 2.觀察db/db小鼠根皮苷干預(yù)對血糖、血脂、甘油三酯、膽固醇、糖基化終末產(chǎn)物、丙二醛、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酐、尿素氮等指標(biāo)的影響，探討根皮苷對db/db小鼠主動脈保護(hù)作用的可能的機(jī)制及其安全性。
　　 3.研究根皮苷對于STAT3蛋白與p-STA

6、T3蛋白在主動脈組織表達(dá)的影響，初步探討根皮苷對db/db小鼠主動脈保護(hù)作用的分子機(jī)制，為開辟糖尿病大血管病變治療的新途徑完善理論基礎(chǔ)。
　　 研究方法:
　　 7周齡雄性C57BLKS/J db/m小鼠8只以及7周齡雄性C57BLKS/J db/db小鼠16只，均飼喂顆粒飼料，飲水不限，觀察1周進(jìn)入實驗。16只db/db小鼠隨機(jī)分為兩組:一組8只為糖尿病根皮苷干預(yù)組(DMT)，每日給予根皮苷(20mg/kg/d)生理鹽

7、水溶液灌胃;另一組8只為糖尿病組(DM)，給予相同體積的生理鹽水灌胃;db/m小鼠8只作為正常對照組(CC)，給予相同體積的生理鹽水灌胃10周。實驗期間每周定期測量體重(BW)并記錄。于10周末，所有小鼠空腹過夜，10％水合氯醛麻醉后(350mg/kg)，腹主動脈取血處死。留取血清檢測空腹血糖(FBG)，甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)、丙二醛(MDA)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素氮(B

8、UN)、肌酐(Cr)等生化指標(biāo)。留取的主動脈用4％多聚甲醛固定后，石蠟包埋、切片，HE染色，進(jìn)行光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡檢查。部分主動脈組織分離后速存于液氮，速凍后-80℃保存，用作蛋白質(zhì)組學(xué)實驗。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.一般觀察
　　 CC組小鼠生長以及精神狀況良好，活躍，毛發(fā)光順。DM組小鼠實驗進(jìn)程中，逐漸表現(xiàn)為污穢無澤，被毛蓬松，少動，明顯多飲、多食、多尿，體重快速增加。DMT組小鼠上述表現(xiàn)有所減輕。<

9、br>　　 2.體重變化
　　 實驗開始時，DM組和DMT組基礎(chǔ)體重?zé)o顯著性差異（P＞0.05），均明顯高于CC組(P＜0.01)。自實驗第2周開始，DM組小鼠體重逐漸增加，該趨勢一直持續(xù)至第10周實驗結(jié)束。然而，DMT組小鼠與DM組相比，在實驗的第2、4、6、8、10周體重均明顯降低(P＜0.01)，表明根皮苷能夠顯著改善DM小鼠的體重。
　　 3.FBG、TC、TG、AGEs、MDA、ALT、AST、BUN、Cr含

10、量檢測結(jié)果
　　 實驗開始時DM組與DMT組間的FBG、AGEs、MDA水平無顯著性差異（P＞0.05），但與CC組比較，兩組FBG、AGES和MDA水平均明顯升高（P＜0.05）。10周末，DM組小鼠FBG、AGEs和MDA均明顯高于CC組(P＜0.01)，DMT組小鼠FBG、AGEs和MDA顯著低于DM組（P＜0.05）。表明根皮苷顯著降低了FBG、TC、TG、AGEs和MDA水平。ALT、AST、BUN、Cr在各組間無差異

11、。
　　 4.主動脈組織學(xué)觀察
　　 正常對照組小鼠主動脈內(nèi)膜光滑，無異常表現(xiàn)。糖尿病組小鼠主動脈管壁增厚，血管內(nèi)膜受損，血管平滑肌細(xì)胞增殖、移行。根皮苷干預(yù)組小鼠比糖尿病小鼠主動脈病變程度減輕。表明根皮苷對糖尿病主動脈有保護(hù)作用。
　　 5.根皮苷對db/db小鼠主動脈STAT3蛋白與p-STAT3蛋白表達(dá)的影響
　　 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting)染色顯示，10周末，與CC組小鼠主

12、動脈組織p-STAT3蛋白表達(dá)相比較，DM組主動脈組織p-STAT3蛋白表達(dá)明顯增多。根皮苷治療后，p-STAT3蛋白表達(dá)則顯著減少。表明根皮苷對STAT3傳導(dǎo)通路有抑制作用。
　　 結(jié)論:
　　 根皮苷能夠有效減輕db/db小鼠體重，減輕主動脈損害。能夠降低小鼠的FBG、改善TC、TG、AGEs、MDA等生化指標(biāo)，對肝、腎功能無影響。根皮苷對db/db小鼠主動脈的保護(hù)作用與其降糖調(diào)脂、降低AGEs水平和抗氧化有關(guān)。根皮

13、苷抑制db/db小鼠主動脈STAT3的磷酸化，提示根皮苷可以通過抑制STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮其血管保護(hù)作用。
　　 根皮苷為純天然物質(zhì)，安全，副作用小，能夠減輕2型糖尿病的血管損害，具有降糖調(diào)脂、抗氧化等多種功效。可望作為一種新型的功能成分，為2型糖尿病并發(fā)癥的防治提供新的思路和手段。
　　 第二部分應(yīng)用iTRAQ技術(shù)探討根皮苷對db/db小鼠主動脈的保護(hù)機(jī)制
　　 研究背景:
　　 隨著人類基因組工作

14、框架的完成，生命科學(xué)的研究進(jìn)入了后基因組時代。科學(xué)家逐漸意識到基因只是遺傳信息的載體，而蛋白質(zhì)才是生命活動的最終執(zhí)行者，是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者，介導(dǎo)幾乎所有的生命活動。因此，除了了解蛋白質(zhì)的數(shù)量、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)以外，全面動態(tài)的了解蛋白質(zhì)的生物功能及不同蛋白質(zhì)相互關(guān)系的變化，才能直接闡明生理或病理條件下生命活動的變化機(jī)制，從而揭示生命活動的規(guī)律和生命現(xiàn)象的本質(zhì)。因此生命科學(xué)的工作重心從獲取生命的全部遺傳信息而漸漸轉(zhuǎn)移到對生命功能的整體探索上來

15、。對蛋白質(zhì)組學(xué)研究也逐漸成為后基因組研究中的核心內(nèi)容。
　　 精確鑒定及定量整個細(xì)胞基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)稱為定量蛋白質(zhì)組學(xué)。定量蛋白質(zhì)組學(xué)的重點是定性定量地解析整個細(xì)胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)的動態(tài)變化，從而反映細(xì)胞功能、過程、機(jī)制等綜合信息。它是功能蛋白質(zhì)組學(xué)的重要內(nèi)容，常被用于分析疾病與健康兩種不同狀態(tài)，以及藥物處理前后細(xì)胞內(nèi)差異表達(dá)的全體蛋白質(zhì)。定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可用于鑒定對疾病具有提示或診斷功能的蛋白質(zhì)，也有助于為疾病的治療發(fā)現(xiàn)

16、具有新功能的靶標(biāo)蛋白。近年來該領(lǐng)域的相關(guān)技術(shù)發(fā)展迅速，全新的應(yīng)用和方法設(shè)計正在不斷推進(jìn)技術(shù)創(chuàng)新。最近，同位素標(biāo)記相對和絕對定量(iTRAQ)技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜分析，已經(jīng)在探討疾病的發(fā)生機(jī)制、尋找疾病標(biāo)志物、以及不同時段或者不同狀態(tài)的多樣本定量分析等蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域得到了很好的應(yīng)用。
　　 根皮苷是蘋果多酚的重要組成成分，作為一種天然多酚類化合物，廣泛存在于蘋果屬的多種植物中，在根、莖、葉與果實中均有分布。根皮苷具有多種生物活性、和藥

17、理作用，比如清除自由基、抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)血糖、保護(hù)心血管以及抗腫瘤的作用。最近的體內(nèi)外實驗表明，根皮苷可以顯著改善糖尿病心肌肥厚、糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜早期周細(xì)胞損傷等并發(fā)癥。本研究第一部分實驗發(fā)現(xiàn):根皮苷對于db/db小鼠主動脈具有明顯的保護(hù)作用。但是迄今為止，根皮苷是通過什么機(jī)制及有效靶標(biāo)蛋白來發(fā)揮對2型糖尿病主動脈的保護(hù)效應(yīng)尚未得到解決。
　　 本研究第二部分應(yīng)用iTRAQ技術(shù)，并利用Turbo SEQUEST軟件與國際

18、蛋白質(zhì)索引（international protein index，IPI）數(shù)據(jù)庫等生物信息學(xué)方法，分離與鑒定正常對照組（CC組），糖尿病組(DM組)與糖尿病根皮苷干預(yù)組(DMT組)三組小鼠主動脈組織的差異表達(dá)蛋白。目的在于揭示根皮苷對于db/db小鼠主動脈的保護(hù)機(jī)制，為研發(fā)預(yù)防和治療糖尿病大血管并發(fā)癥的有效藥物提供潛在靶標(biāo)和新的視角。
　　 研究目的:
　　 1.獲得db/db小鼠主動脈組織的全部蛋白質(zhì)的差異表達(dá)情況，

19、進(jìn)一步了解在糖尿病狀態(tài)下主動脈損傷的蛋白質(zhì)組學(xué)改變。
　　 2.探討db/db小鼠經(jīng)根皮苷治療后主動脈組織的差異表達(dá)蛋白，篩選并初步驗證藥物作用的關(guān)鍵蛋白與候選靶標(biāo)，從蛋白質(zhì)組學(xué)角度進(jìn)一步揭示根皮苷對于糖尿病主動脈的保護(hù)機(jī)制，為開辟糖尿病大動脈病變的治療新途徑奠定實驗基礎(chǔ)。
　　 研究方法:
　　 CC組、DM組與DMT組三組小鼠中各選取4只小鼠，分離主動脈組織。按照iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)要求的樣本制備標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)

20、流程，如主動脈組織研磨、切碎、超聲破碎、裂解等提取主動脈總蛋白，并以Bradford蛋白質(zhì)定量法測定蛋白質(zhì)濃度，分裝提取樣品，-80℃保存?zhèn)溆?。提取各組主動脈總蛋白后，各組上樣20ug樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)觀察各組之間電泳后蛋白點遷移平行度。各組主動脈總蛋白采用FASP酶解得到相應(yīng)各組肽段。各組取60ug肽段，按照ABI公司說明書操作與標(biāo)記消化后的各組肽段，依次分別為114標(biāo)記CC組，116標(biāo)記DMT組，

21、117則標(biāo)記DM組。標(biāo)記結(jié)束后利用ABI4800 MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀各組均隨機(jī)選取一定數(shù)量肽段，并檢測其二級質(zhì)譜圖中低分子量端是否存在相應(yīng)質(zhì)量標(biāo)記試劑，確定標(biāo)記成功。將各組已標(biāo)記的肽段混合，然后用Agilent HPLC1200強(qiáng)陽離子交換柱(strong cation exchange，SCX)進(jìn)行分離分級，收集穿流以及洗脫部分合并成10組，之后予以C18 Cartridge(Sigma)脫鹽，進(jìn)行下一步質(zhì)譜鑒定。本研究

22、第二部分使用Thermo Finnigan LTQVelos質(zhì)譜儀進(jìn)行液相質(zhì)譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析(LC-ESI-MS/MS)。質(zhì)譜儀在線配備0.15mm*150mm C-18反相色譜柱(RP-C18 Column Technology Inc)，液相A液為0.1％甲酸水溶液，B液為0.1％甲酸乙腈水溶液（乙腈為84％）。質(zhì)譜的進(jìn)樣方式為采用微毛細(xì)管上樣，溫度為200度，檢測方式為正離子。一次全掃描后收集5個碎片圖譜來獲得多肽和多肽碎片的m/

23、z比。原始文件用iTRAQ Result MultipleFile Distiller分析定量數(shù)據(jù)，并用Sequest軟件鑒定多肽分子。最后，使用相關(guān)軟件將定量及檢定結(jié)果進(jìn)行合并處理，得到定量和鑒定結(jié)果。定量方法采用Identified iTRAQ Statistic Builder軟件分析，采用軟件計算的ratio_biweight值作為蛋白質(zhì)定量結(jié)果，以114標(biāo)記為內(nèi)參。搜索使用的數(shù)據(jù)庫為ipi.MOUSE.v3.72.REVERS

24、ED.fasta蛋白庫(Sequest結(jié)果過濾參數(shù)為:Protein FDR≤0.01;Peptide FDR≤0.01)。應(yīng)用EXPASY蛋白質(zhì)組學(xué)工具分析等電點、分子量等。并采用基因本體論GO(http://www.geneontology.org)對經(jīng)鑒定的主動脈組織蛋白質(zhì)進(jìn)行分類。分別從細(xì)胞組成、分子功能及生物過程對蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行定位分類與功能分析。選取兩個差異表達(dá)的關(guān)鍵蛋白經(jīng)Western blotting來驗證其在糖尿病小

25、鼠主動脈組織中的表達(dá)情況。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.小鼠主動脈組織總蛋白SDS-PAGE結(jié)果
　　 結(jié)果提示各組主動脈SDS-PAGE蛋白質(zhì)點遷移條帶清晰，各組間平行度較好，可以進(jìn)行下一步實驗。
　　 2.iTRAQ標(biāo)記統(tǒng)計學(xué)驗證
　　 本部分以114標(biāo)記的正常組小鼠主動脈蛋白樣品做為對照，將117標(biāo)記的糖尿病組小鼠和116標(biāo)記的根皮苷治療組小鼠主動脈蛋白樣品與對照的比值進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示

26、幾種標(biāo)記試劑進(jìn)行的蛋白標(biāo)記實驗均一性好，并提示10％的蛋白有顯著性差異，符合統(tǒng)計學(xué)的規(guī)律。
　　 3.質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析結(jié)果
　　 本研究使用高效液相色譜分離與電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜分析(LC-ESI-MS/MS)在線獲取的MS/MS原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)，采用Turbo SEQUEST程序自動進(jìn)行非冗余IPI小鼠蛋白數(shù)據(jù)庫搜索，共鑒定到的唯一肽段15825條，共有3083種蛋白質(zhì)，其中有定量信息的蛋白有1512種（過濾參數(shù):蛋白質(zhì)FDR≤0

27、.01;肽段FDR≤0.01）。
　　 本研究中，以114標(biāo)記的正常組小鼠主動脈蛋白樣品做為對照，將117標(biāo)記的糖尿病組小鼠和116標(biāo)記的根皮苷治療組小鼠主動脈蛋白樣品與對照的比值進(jìn)行統(tǒng)計分析。比值小于0.67或大于1.5的蛋白即為根皮苷治療(20 mg/kg/day)10周后表達(dá)明顯下調(diào)或者上調(diào)的主動脈組織蛋白。與正常對照小鼠組相比，DM組主動脈的差異表達(dá)蛋白557個，其中，表達(dá)增高的點463個，降低的點94個。另外，與非治療

28、組相比，糖尿病小鼠經(jīng)根皮苷治療后主動脈有70個差異表達(dá)蛋白的表達(dá)水平恢復(fù)，其中50個蛋白的表達(dá)降低，20個蛋白表達(dá)增高。
　　 4.根皮苷干預(yù)后主動脈差異蛋白質(zhì)的定位分析
　　 應(yīng)用UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org)的GO分析以及相關(guān)文獻(xiàn)，對糖尿病小鼠主動脈差異表達(dá)的70個蛋白分析進(jìn)行定位分類。主動脈差異表達(dá)蛋白中胞漿蛋白比例最大，占23.08％。其次是核蛋白和膜蛋白，分別占15.3

29、8％和13.9％，線粒體蛋白和高爾基結(jié)構(gòu)蛋白均占8.79％，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白占7.69％，另外還有少量核糖體蛋白和溶酶體蛋白，分別占2.20％和1.10％。
　　 5.根皮苷干預(yù)后主動脈差異蛋白質(zhì)的功能分析
　　 利用GO分析結(jié)合UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫以及相關(guān)文獻(xiàn)，將LC-ESI-MS/MS鑒定得出的根皮苷干預(yù)后的70個主動脈差異蛋白點進(jìn)行功能分析。差異蛋白中的與三大物質(zhì)代謝相關(guān)的蛋白所占比例最大，達(dá)到17.28％。其次是結(jié)

30、合蛋白，達(dá)到16.05％。參與氧化應(yīng)激和ATP合成的蛋白占11.11％。介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、參與細(xì)胞周期調(diào)控及增殖的蛋白占9.88％。結(jié)構(gòu)蛋白和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白分別占8.64％和4.94％。
　　 6.Westem blotting驗證差異蛋白在主動脈組織的表達(dá)改變
　　 我們采用Westem blotting的方法選擇STEAP4和PDE5A兩個蛋白來驗證iTRAQ聯(lián)合LC-ESI-MS/MS鑒定的差異蛋白的結(jié)果的可靠性。與正常

31、對照組比較，db/db小鼠主動脈STEAP4和PDE5蛋白表達(dá)明顯增加;根皮苷治療10周后，糖尿病主動脈STEAP4和PDE5蛋白表達(dá)顯著降低。因此，經(jīng)Western blotting驗證重點選取的差異蛋白STEAP4和PDE5A在主動脈組織上的表達(dá)與iTRAQ技術(shù)獲得的蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果相符合，說明iTRAQ技術(shù)的實驗結(jié)果真實可靠。
　　 結(jié)論:
　　 1.iTRAQ技術(shù)能夠同時對多組樣本進(jìn)行比較分析，可以獲得更好的蛋白質(zhì)

32、組覆蓋率。iTRAQ技術(shù)用于研究根皮苷對db/db小鼠主動脈保護(hù)作用的分子機(jī)制有助于發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標(biāo)。
　　 2.應(yīng)用LC-ESI-MS/MS鑒定得到根皮苷干預(yù)db/db小鼠主動脈差異表達(dá)蛋白70個，其中下調(diào)點50個點，上調(diào)點20個，其功能涉及到細(xì)胞代謝、氧化應(yīng)激、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡等，提示這些過程與機(jī)制可能參與了糖尿病主動脈病變的發(fā)生與發(fā)展。
　　 3.Western blotting證實db/db