盡早干預(yù)對db-db糖尿病小鼠胰島β細(xì)胞保護(hù)的研究和肝細(xì)胞脂毒性體外干預(yù)研究.pdf

1、本論文分兩部分介紹：第一部分:盡早干預(yù)對db/db糖尿病小鼠胰島β細(xì)胞保護(hù)的探討
　　 目的:探討在血糖正常期和糖尿病早期采取不同方式對db/db小鼠進(jìn)行干預(yù)對胰島β細(xì)胞的保護(hù)。
　　 方法:(1)選取血糖正常的雄性db/db小鼠98只,分別在4周齡(血糖正常)和6周齡(糖尿病早期)時進(jìn)行干預(yù),各分為4個干預(yù)組:利拉魯肽(Liraglutide,LIRA)、吡咯列酮(Pioglitazone,PIO)、限制飲食(Calo

2、ries restriction,CR)和運(yùn)動(Exercise,EX),另設(shè)1個對照組。入組前及干預(yù)結(jié)束時測定糖化血紅蛋白(Glycosylatedhemoglobin,HbA1c)。每周監(jiān)測小鼠空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG)、體重和進(jìn)食量。小鼠12周齡時結(jié)束干預(yù),分別進(jìn)行腹腔注射糖耐量試驗(yàn)(Intraperitonealglucose tolerance test,IPGTT)和胰島素耐量試驗(yàn)(Ins

3、ulin tolerance test,ITT)評價糖耐量、胰島素釋放反應(yīng)及胰島素敏感性。檢測血漿甘油三酯(Tdglyceride,TG)、游離脂肪酸(free fatty acids,FFA)、脂聯(lián)素和胰高血糖素濃度。免疫組織化學(xué)方法檢測胰島β細(xì)胞質(zhì)量、增殖(Brdu)和凋亡(TUNEL)；檢測胰島PDX-1和IRS-2表達(dá)變化。實(shí)時熒光定量PCR檢測胰腺GRP78、CHOP mRNA、microRNA miR-34a、miR-375

4、表達(dá),普通PCR檢測胰腺XBP-1/spliced XBP-1 mRNA表達(dá)。Western blot檢測胰腺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物GRP78和CHOP蛋白表達(dá)。(2)35只8周齡db/db小鼠分為4周:對照組,PIO組,LIRA組,及PIO+LIRA聯(lián)合治療組,治療4周后行IPGTT和ITT試驗(yàn)。測定血漿胰島素、脂聯(lián)素、游離脂肪酸和甘油三酯濃度。免疫組織化學(xué)方法檢測胰島β細(xì)胞質(zhì)量、增殖(Brdu)和凋亡(TUNEL)水平。結(jié)果:1.(1)與

5、未處理組相比,干預(yù)結(jié)束時各組血糖顯著降低(HbA1c:對照組7.3±0.3％,4周齡干預(yù)組4.9±0.8％,6周齡干預(yù)組5.5±0.9％,P<0.001);IPGTT120min血糖曲線下面積顯著降低(AUCglu:對照組4568±190 mmol/1*min,4周齡干預(yù)組2306±727 mmol/l*min,6周齡干預(yù)組3559±903 mmol/l*min,P<0.001)。不同干預(yù)方式之間存在差別(HbA1c:LIRA組4.9±

6、0.5％,PIO組4.3±0.4％,CR組5.4±0.7％,EX組6.1±0.6％,P<0.001),糖耐量的改善與HbA1c一致(AUCglu:LIRA組2558±639mmol/1*min,PIO組1662±483 mmol/l*min,CR組3262±613 mmol/l*min,EX組3904±610 mmol/l*min,P<0.001)。(2)空腹胰島素較對照組升高(對照組:5.7±2.5ng/ml,4周齡干預(yù)組11.0±3

7、.0ng/ml,6周齡干預(yù)組9.1±4.6ng/ml P<0.01)。4周齡干預(yù)組較6周齡干預(yù)組輕度升高(P<0.05)。除LIRA(12.3±3.4ng/ml,p=0.001)以外,其它組小鼠空腹胰島素水平的差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義。胰島β細(xì)胞的胰島素分泌反應(yīng)得到不同程度的恢復(fù),IPTGTT120min胰島素曲線下面積(AUCglu:對照組799±186ng/ml*min,4周齡干預(yù)組1410±595ng/ml*min,6周齡干預(yù)組12

8、16±347ng/ml*min,P<0.05)。對照組胰島素曲線低平,LIRA組和PIO組在30min出現(xiàn)分泌高峰,升高幅度分別為2.0倍和2.1倍,二者沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CR組胰島素分泌高峰延遲,EX組胰島素分泌曲線和對照組類似。(3)血漿TG、FFA、胰高血糖素水平降低,4周齡干預(yù)組和6周齡干預(yù)組相比均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。PIO組脂聯(lián)素水平升高(9.5±1.6 vs.15.3±3.9mg/l,P

9、)胰島免疫組織化學(xué)分析顯示,對照組胰島肥大,免疫組化顯示胰島β細(xì)胞減少,胰島素染色變淺,呈嚴(yán)重脫顆粒。胰島α細(xì)胞增多,分布紊亂,由胰島周邊向中心遷移,散在分布在整個胰島。胰島素染色面積明顯增加(對照組27.0±1.5％,4周齡干預(yù)組50.8±6.4％,6周齡干預(yù)組44.5±8.1％,P<0.001)。與對照組相比,PIO組胰島明顯變小,胰島β細(xì)胞增多,無脫顆粒現(xiàn)象,胰島α細(xì)胞分布正常；LIRA組和CR組胰島肥大,胰島β細(xì)胞增多,脫顆粒較

10、對照組減輕,胰島α細(xì)胞分布改善；EX組胰島肥大,β細(xì)胞數(shù)量和胰島素含量輕度增多,脫顆粒及胰島α細(xì)胞分布無明顯改善。胰島β細(xì)胞的質(zhì)量和血糖的控制呈現(xiàn)一致的趨勢。LIRA組和CR組胰島β細(xì)胞增殖較對照組明顯增多(P<0.05)。β細(xì)胞凋亡在LIRA、PIO和CR組受到不同程度的抑制。(5)胰島PDX-1和IRS-2表達(dá)在LIRA組和PIO組均較對照組明顯增加,其中LIRA組PDX-1表達(dá)較PIO組多,而PIO組IRS-2表達(dá)顯著強(qiáng)于LIRA

11、組。(6)LIRA組和PIO組胰腺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激顯著抑制,CR組和EX組沒有明顯變化。(7)LIRA降低miR-34a(71％,P<0.05)和miR-375(51％,P<0.05)表達(dá)。
　　 2.各治療組血糖顯著降低,PIO+LIRA聯(lián)合治療組降糖效果優(yōu)于單藥組(糖化血紅蛋白對照組:7.3±0.4％,PIO:4.9±0.6％,LIRA:5.5±0.4％,PIO+LIRA:4.5±0.6％);與對照組相比IPGTT120min血糖

12、曲線下面積降低56％(P<0.001),IPGTT120min胰島素曲線下面積增加91％(P<0.01)；脂聯(lián)素升高95％(P<0.05)；游離脂肪酸降低29％(P<0.05),甘油三酯降低49％(P<0.01),均優(yōu)于單藥組；胰島組織切片胰島素陽性面積增加1.7倍(P<0.001),胰島新生β細(xì)胞比例增加2倍(P<0.01),均優(yōu)于單藥組。聯(lián)合治療顯著改善胰島α細(xì)胞分布,促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖,恢復(fù)正常的胰島形態(tài)。
　　 結(jié)論:1

13、.盡早干預(yù)更有利于對胰島β細(xì)胞及其功能的保護(hù),提示2型糖尿病盡早干預(yù)的必要。2.利拉魯肽直接保護(hù)胰島β細(xì)胞及其功能,但只能部分代償嚴(yán)重的胰島素抵抗。3.吡格列酮聯(lián)合利拉魯肽治療相比單藥更好地改善db/db小鼠糖脂代謝和保護(hù)胰島β細(xì)胞功能。
　　
　　 目的:探討京尼平減輕棕櫚酸對HepG2細(xì)胞毒性的作用及機(jī)制。
　　 方法:HepG2細(xì)胞分為空白組、棕櫚酸組、京尼平組和京尼平預(yù)處理的棕櫚酸組,分別用牛血清白蛋白

14、、棕櫚酸(1mmol/l)、京尼平(20μmol/l)或京尼平(20μmol/l)預(yù)處理30min后棕櫚酸(1mmol/l)孵育24h,檢測細(xì)胞活力(MTT)及乳酸脫氫酶(LDH)釋放；孵育16h后流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡；孵育6h后實(shí)時熒光定量PCR檢測、GRP78、CHOP基因表達(dá),PCR結(jié)合電泳檢測XBP-1裂解。
　　 結(jié)果:和空白組相比,棕櫚酸減低HepG2細(xì)胞活力、增加LDH釋放(P<0.01),增

15、加HepG2細(xì)胞凋亡(P<0.05),上調(diào)GRP-78和CHOP表達(dá)(P<0.05)及XBP-1裂解；和棕櫚酸組相比,京尼平增加細(xì)胞活力(P<0.05)、減少LDH釋放(P<0.05),顯著抑制細(xì)胞凋亡(P<0.01),降低GRP-78和CHOP基因表達(dá)(P<0.01)及XBP-1裂解。
　　 結(jié)論:京尼平具有抗棕櫚酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡的作用,可能與抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。
　　 目的:探討過氧化物酶體增殖激活受體γ(PPAR

16、-γ)或α(PPAR-α)在肝細(xì)胞糖代謝和胰島素抵抗改善中扮演的角色。
　　 方法:體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞并用高濃度棕櫚酸處理建立胰島素抵抗模型,分別給予PPAR-γ激動劑吡格列酮或高選擇性PPAR-α激動劑WY14643處理,酶法測定葡萄糖的消耗量和糖酵解產(chǎn)物乳酸、丙酮酸；實(shí)時熒光定量PCR測定PPAR-γ,PPAR-α,及糖酵解相關(guān)基因烯醇酶1(ENO1)、肝型6-磷酸果糖激酶(PFKL)、磷酸甘油酯激酶(PGK

17、1)和丙酮酸激酶M2(PKM2)mRNA表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:吡格列酮增加胰島素抵抗的HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗,誘導(dǎo)糖酵解相關(guān)基因PFKL、PGK1和PKM2表達(dá)顯著上調(diào),糖酵解產(chǎn)物乳酸和丙酮酸生成增多。WY14643部分改善HepG2細(xì)胞胰島素抵抗,對糖酵解相關(guān)基因表達(dá)及糖酵解產(chǎn)物生成沒有顯著影響。吡格列酮或WY14643對ppAR-γ或PPAR-αmRNA的表達(dá)沒有影響。
　　 結(jié)論:PPAR-γ激動劑通過促進(jìn)糖