γ-生育酚改善db-db小鼠血管功能及其作用機制.pdf

1、研究背景:內皮功能障礙是多種代謝性疾病的一種特性，是早期血管功能障礙的一個關鍵事件。氧化應激是引起內皮功能障礙的重要機制之一。維生素 E是細胞抗氧化防御系統(tǒng)中主要的脂溶性成分。許多臨床研究以α-生育酚的形式補充維生素 E，作為一種改善內皮功能和降低心血管疾病風險的方法，但是效果并不明確。近年來一些臨床和動物實驗表明，γ-生育酚可能是維生素 E實際上的保護性亞型，通過不同機制起到心血管保護作用。
　　內皮型一氧化氮合酶（eNOS）是

2、血管一氧化氮（NO）的主要來源，也是一個具有抗炎作用的細胞保護分子。在糖尿病和與胰島素抵抗相關的心血管疾病如高血壓和動脈粥樣硬化中都存在 NO的生物利用度減少的現象。因此，改善內皮細胞NO生物利用度將對緩解/治療內皮功能障礙相關心血管疾病有重要意義。γ-生育酚可以上調eNOS并促進NO形成，可能在防治血管內皮功能障礙中發(fā)揮重要作用。
　　雖然親脂性的γ-生育酚有直接的抗氧化和抗炎作用，但它很容易在肝臟以細胞色素P450（CYP45

3、0）依賴的方式代謝成其生理水基代謝物γ-2-（2'-羧乙基）羥基苯并二氫吡喃（γ-CEHC）。雖然以往的研究支持γ-生育酚自身在嚙齒動物和人類的有利影響，但對其生理代謝產物γ-CEHC的作用尚并不清楚。有限的證據表明，γ-CEHC可以抑制內皮細胞在炎癥刺激時的炎性反應，然而，γ-CEHC是否可以在糖尿病和/或代謝綜合征等高血糖條件下改善內皮細胞的eNOS信號尚不清楚。
　　實驗目的:
　　1.明確γ-生育酚是否通過激活eNO

4、S/NO信號通路和降低炎癥反應，改善高血糖引起的內皮功能障礙。
　　2.闡明γ-生育酚保護血管功能的具體機制，尤其是其代謝產物γ-CEHC在其中的作用。
　　實驗方法:
　　1.實驗分組：（1）正常對照組（CON），8周齡正常野生型C57Bl/6小鼠，給予標準飼料（Research Diets Inc., New Brunswick, NJ）喂養(yǎng)，含10％脂肪，70%碳水化合物和20%蛋白（kCal）；（2）db/db

5、小鼠組（db/db），db/db小鼠給予標準飼料喂養(yǎng)；（3）db/db小鼠+γ-生育酚組（db/db+γ-T），db/db小鼠給予標準飼料，并按照γ-生育酚500 mg/kg體重的比例給予。經過1周適應環(huán)境后，所有小鼠都按照上述條件喂養(yǎng)8周。8周后檢測各組小鼠的代謝指標和心血管表型。
　　2.離體觀察外周血管收縮舒張功能：制備股動脈環(huán)（內徑約150μm）檢測血管反應性。給予氯化鉀（KCl）誘導血管最大張力（Lmax），用苯腎上腺素

6、（PE,1μM）使血管環(huán)預收縮65%的Lmax張力，分別給予乙酰膽堿（ACh,10-8-10-6 mol/L）、硝普鈉（SNP,10-9-10-4 mol/L）檢測內皮依賴性和非內皮依賴性血管舒張的劑量反應曲線。分別給予PE（10-9-10-4 mol/L）、KCl（20-100 mM）檢測受體依賴性和非受體依賴性血管收縮的劑量反應曲線。給予NOS抑制劑（L-NAME），檢測各組小鼠血管的收縮反應。
　　3.培養(yǎng)牛主動脈血管內皮細

7、胞（BAECs）：在培養(yǎng)基中添加35 mM葡萄糖孵育48 h制造高糖模型，同時給予生理濃度的γ-生育酚（1.2μM），處理結束前10 min給予100 nM胰島素，處理結束后收集細胞分別用免疫印跡方法、q-RT PCR方法和ELISA方法探討γ-生育酚的保護作用及機制。
　　4.人主動脈血管內皮細胞（HAECs）細胞培養(yǎng)：使用生理濃度的γ-CEHC（3μM）對HAECs預處理24 h，再在培養(yǎng)基中添加20 mM葡萄糖制造高糖模型孵

8、育48 h，處理結束前10 min給予100 nM胰島素，處理結束后收集細胞分別用免疫印跡方法、q-RT PCR方法和ELISA方法觀察γ-CEHC的保護作用及機制。
　　5.采用免疫印跡方法檢測 eNOS， p-eNOSSer1177， Akt， p-AktSer473， ERK， p-ERKThr2023/Tyr204，AMPK，p-AMPKThr172，GSK3β，p-GSK3βSer9，ACC，p-ACCSer79，硝基酪

9、氨酸和eNOS dimers/monomers的蛋白表達水平。
　　6.采用q-RT PCR方法檢測細胞粘附因子（ICAM），血管細胞粘附分子-1（VCAM-1），E-Selectin，單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）和白細胞介素-8（IL-8）的基因表達水平。
　　7.采用ELISA方法檢測細胞內NO和ROS的水平。
　　實驗結果:
　　1.與對照組相比，db/db組小鼠的體重、肝臟和脂肪的重量顯著增加，給予

10、γ-生育酚的db/db小鼠體重下降但是肝臟和脂肪的重量不變；與對照組相比， db/db組小鼠的禁食后血糖、HDL和甘油三酯顯著增高，給予γ-生育酚對這些指標無影響；在各組實驗小鼠中，心臟重量和總膽固醇量無顯著變化。
　　2.與對照組相比，db/db組小鼠內皮依賴性舒張功能顯著降低，給予γ-生育酚后得到恢復。各組小鼠之間血管的非內皮依賴性舒張、受體介導的收縮和非受體介導的收縮無顯著差異。與對照組相比，db/db組小鼠通過L-NAME

11、誘發(fā)的血管收縮顯著降低，給予γ-生育酚后得到恢復。股動脈起始寬度，結束寬度，長度，最大靜息張力，內皮依賴性舒張百分比，非內皮依賴性舒張百分比和給予NOS抑制劑后的舒張百分比，各組之間無顯著差異。
　　3.與對照組相比，db/db組小鼠血管eNOSSer1177的磷酸化水平顯著降低，給予γ-生育酚后得到恢復。與對照組相比，db/db組小鼠血管 AktThr308的磷酸化水平，AMPKThr172的磷酸化水平和ERK1/2Thr202

12、/Tyr204的磷酸化水平，各組之間無顯著差異。
　　4.與對照組相比，高糖組胰島素刺激引起的eNOSSer1177的磷酸化水平和NO水平都顯著降低，給予γ-生育酚預處理后得到恢復。在不同的處理組之間，基礎的eNOSSer1177的磷酸化水平和NO水平無顯著差異。
　　5.與對照組相比，高糖孵育48 h后，BAECs中總ROS-RNS水平顯著增加；給予γ-生育酚處理能降低高糖引起的ROS-RNS水平，使總ROS-RNS水平恢

13、復至對照組水平。與對照組相比，高糖能顯著增加炎癥因子和粘附因子的表達；但是，給予γ-生育酚處理能顯著降低高糖引起的炎癥因子增高。
　　6.與對照組相比，高糖組胰島素刺激引起的 eNOSSer1177的磷酸化水平，AktSer473的磷酸化水平和NO水平都顯著降低；給予γ-CEHC預處理后得到恢復。在不同的處理組之間，基礎 eNOSSer1177的磷酸化水平和 NO水平無顯著差異。AMPKThr172的磷酸化水平，ERK1/2Thr

14、202/Tyr204的磷酸化水平，GSK3βSer9的磷酸化水平和ACCSer79的磷酸化水平各組之間無顯著差異。
　　7.與對照組相比，高糖孵育48 h后，HAECs中總ROS-RNS水平和硝基酪氨酸蛋白表達顯著升高；給予γ-CEHC預處理能阻止高糖引起的ROS-RNS水平增加，使總ROS-RNS水平與對照組類似。與對照組相比，高糖孵育48 h后，HAECs中eNOS解偶聯(lián)顯著增加；給予γ-CEHC預處理能防止高糖引起的eNOS

15、解偶聯(lián)，使eNOS保留一個正常的二聚體與單體的比例。
　　8.與對照組相比，高糖能顯著增加炎癥因子和粘附因子（ICAM, VCAM-1, E-Selectin, MCP-1和 IL-8）的基因表達。給予γ-CEHC預處理能顯著降低高糖引起的ICAM, VCAM-1, E-Selectin, MCP-1和IL-8基因表達增高。
　　結論:
　　1.γ-生育酚可以改善高血糖所致的血管功能障礙；
　　2.γ-生育酚通過