典型兒茶素和茶黃素分離分析及其緩解雌性db-db小鼠代謝綜合征的研究.pdf

1、中國是世界產(chǎn)茶大國，茶葉種類繁多、品種齊全，對我國經(jīng)濟貢獻良多。世界范圍內(nèi)，飲茶的習(xí)慣歷史悠久，流傳頗廣。越來越多的科學(xué)研究表明飲茶能促進健康，飲茶尤其是綠茶和紅茶能預(yù)防肥胖癥，抵抗癌癥，改善心血管狀態(tài)，緩解神經(jīng)退行性疾病。報道最多的茶葉活性物質(zhì)分別是綠茶中的兒茶素（以EGCG為主）和紅茶中的茶黃素。但是迄今還未有高效制備高純度茶葉活性物質(zhì)單體的分離純化方法為茶葉健康功效分子機制研究提供原料，大多數(shù)研究采用綠茶提取物和紅茶提取物為研究對

2、象。因此本論文研究了從綠茶中高效制備非酯型兒茶素單體，以及從茶黃素混合物中制備高純度茶黃素單體TF和EGC的方法，并且建立了我國6大茶類中15種典型活性成分高效UHPLC含量測定方法，以此為基礎(chǔ)調(diào)查了我國243個茶葉樣品中15種特征成分在各類茶葉的分布特點，另外探索了膳食添加0.1％兒茶素混合物與茶黃素混合物對db/db雌性小鼠代謝綜合征的緩解作用。具體研究內(nèi)容如下:
　　(1)綠茶中兒茶素EGCG和ECG含量較高，但非酯型兒茶素

3、如EGC和另外EC分離研究較少，如何高效純化綠茶中非酯型兒茶素有較大意義。本論文以綠茶為實驗原料，經(jīng)過咖啡因脫除工藝，萃取制備兒茶素提取物(CE)。CE經(jīng)單寧酶處理制備非酯型幾茶素混合物(NCE)，對非酯型幾茶素EGC和EC進行富集化，含量分別達到390 mg/g和170 mg/g。利用高速逆流色譜法，以正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(1∶10∶1∶10，v/v/v/v)為兩相體系，采用順轉(zhuǎn)與反轉(zhuǎn)模式相結(jié)合純化制備兒茶素。在此最優(yōu)純化條件下

4、，100 mg CE和100 mg NCE混合物可以純化制備27.2 mg98.8％純度的EGCG，14.1 mg97.7％純度的EGC，以及9.3 mg98.9％純度的EC和16.6 mg GA。在反轉(zhuǎn)模式下，80 mg CE和80 mg NCE混合物可以純化獲得19.9 mg95.0％純度的EGCG，5.8 mg95.7％純度的ECG，8.9mg96.4％純度的EC和15.8 mg GA。
　　(2)茶黃素混合物中茶黃素單體含

5、量較少，混合物中殘留兒茶素較多，雜質(zhì)含量較高，如何從中高效分離制備大量高純度兒茶素和茶黃素單體極具挑戰(zhàn)。本論文以茶黃素混合物為原料，經(jīng)過單寧酶水解處理，脫除咖啡因，萃取后得到茶黃素酶解產(chǎn)物(TBP)。TBP中茶黃素單體TF和EGC的含量提高了約3倍，分別達到323 mg/g和152 mg/g。利用高速逆流色譜法，在反轉(zhuǎn)模式下，以正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(1∶8∶1∶8，v/v/v/v)為兩相體系，在最優(yōu)條件下可單次進樣500 mgTB

6、P制備180.8 mg97.3％純度的TF，87.5 mg95.7％純度的EGC和15.1 mg96.2％純度的EC。與高速逆流色譜法相比，制備液相色譜法以55.5％乙腈為洗脫液，最大進樣量為120 mg TBP，一次分離過程能制備11.2 mg94.9％純度TF和7.7 mg92.7％純度EGC。單寧酶水解結(jié)合高速逆流色譜法制備純化TF和EGC效率高，優(yōu)勢明顯。
　　(3)為了調(diào)查我國5大類茶葉資源中15種茶葉特征活性物質(zhì)含量分

7、布，以0.2％甲酸和乙腈為流動相建立了一套快速、準(zhǔn)確的UHPLC方法。本方法能在30分鐘的測試時間內(nèi)較好分離我國6大類茶葉，印非發(fā)酵茶如綠茶和白茶、半發(fā)酵茶如烏龍茶和黃茶以及全發(fā)酵茶如紅茶和普洱中15種活性物質(zhì)含量。結(jié)果表明，白茶和綠茶中幾茶素含量變化不大，兒茶素含量與茶樹品種和制作工藝密切相關(guān)。發(fā)酵類茶如黃茶、烏龍茶、紅茶和普洱茶，會隨著發(fā)酵程度的提高，其兒茶素含量逐漸減少，茶黃素含量升高，表明幾茶素在此過程中氧化轉(zhuǎn)化為幾茶素二聚體，

8、茶黃素。樣品中咖啡因和可可堿含量比較穩(wěn)定，與茶樹品種關(guān)聯(lián)性小。GA含量變化顯著，發(fā)酵程度越高，GA含量越高。
　　(4)采用上述構(gòu)建的UHPLC方法測定了5大類茶葉共243個茶葉樣品中15種茶葉特征物質(zhì)的含量。調(diào)查結(jié)果顯示:與其它同樣以我國茶葉樣品為對象的調(diào)查研究相比，綠茶于白茶中主要幾茶素含量差異不大。EGCG、EGC、ECG和EC是白茶綠茶和烏龍茶中含量最高的兒茶素。所有茶葉中咖啡因含量波動不大。茶葉中GA含量在不同茶葉類別中

9、含量差異較大，以發(fā)酵茶類紅茶中含量較高。與紅茶中茶黃素含量比較，烏龍茶中茶黃素含量較低。比較有趣的是，在君山銀針黃茶中檢測到較高含量的茶黃素，該結(jié)果值得進一步大范圍內(nèi)對我過著名黃茶品種進行調(diào)查。為了更好區(qū)分不同種類的茶葉，通過主成分分析法對樣品量較多的4類茶進行分析，結(jié)果表明能提取出3個主成分因子，解釋所有樣品中85％的數(shù)據(jù)特征。通過制作三維散點圖，4大類茶葉樣品間能得到很好的區(qū)分，并且與實際茶葉特征相符。
　　(5)探討了綠茶幾

10、茶素與紅茶茶黃素緩解db/db雌性小鼠代謝綜合征的效果。膳食添加0.1％兒茶素混合物與茶黃素混合物對db/db雌性小鼠體重、飲食量、飲水量影響不大。兒茶素能顯著緩解代謝綜合征典型特征，即降低血糖、血脂、血清膽固醇，但是對茶黃素功效甚微。兒茶素能提高小鼠胰島分泌胰島素的水平，能減緩胰島素抵抗。初次探索茶黃素在db/db雌性小鼠體內(nèi)藥物代謝途徑與分布，在血清、尿液、肝臟等樣品中未能檢測到茶黃素存在。通過計算糞便中茶黃素回收率發(fā)現(xiàn)，近26％的