丁苯酞對(duì)db-db小鼠認(rèn)知功能障礙及突觸可塑性相關(guān)信號(hào)通路的影響.pdf

1、目的：糖尿病可引起癡呆及認(rèn)知功能障礙，但具體機(jī)制尚不清楚。海馬突觸可塑性為大腦學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)，而長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（Long-term Potentiation，LTP）為評(píng)估海馬神經(jīng)環(huán)路突觸傳遞可塑性的重要指標(biāo)。有研究顯示，糖尿病可影響突觸傳遞，抑制海馬區(qū)LTP的產(chǎn)生與維持。其中，LTP誘導(dǎo)及形成的分子機(jī)制可簡(jiǎn)述為：谷氨酸釋放，引起突觸后膜N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）谷氨酸受體激活，Ca2+內(nèi)流，并與鈣調(diào)蛋白（CaM）形成Ca

2、2+/CaM復(fù)合物，進(jìn)一步活化鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶-II（ CaMKII），最終導(dǎo)致α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑-丙酸（AMPA）谷氨酸受體遷入突觸后膜、電導(dǎo)增強(qiáng)，產(chǎn)生LTP。丁苯酞是一種神經(jīng)保護(hù)性藥物，具有改善腦部微循環(huán)、抑制炎癥反應(yīng)、保護(hù)線粒體等作用，目前廣泛用于缺血性腦血管病的治療，已有研究表明，其對(duì)糖尿病認(rèn)知功能障礙也有明顯的改善作用。故在本研究中，我們通過(guò)應(yīng)用丁苯酞，觀察其對(duì)2型糖尿病模型db/db小鼠學(xué)習(xí)記憶障

3、礙及海馬神經(jīng)元NMDAR-CaMKII-AMPAR通路的影響。
　　方法：
　　1.動(dòng)物分組
　　16只6周齡的健康雄性db/db小鼠(體重38g~42g)，隨機(jī)分為：糖尿病對(duì)照組（DM組，n=8）和丁苯酞干預(yù)組(DM-NBP，n=8)，8只同周齡體瘦的、非糖尿病db/m小鼠（體重17~19g）作為正常對(duì)照組（NC，n=8）。
　　2.藥物干預(yù)
　　適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，DM-NBP組小鼠每天給予溶解于植物油中

4、的丁苯酞灌胃，劑量為120mg/kg/d，NC組和DM組僅給予等量的植物油灌胃，每日1次，共持續(xù)6周。
　　3.一般情況觀察
　　觀察并記錄小鼠精神狀態(tài)、皮毛光澤、進(jìn)食水及尿量等情況，同時(shí)檢測(cè)小鼠的體重及血糖變化。
　　4.行為學(xué)檢測(cè)
　　各組小鼠分別于丁苯酞干預(yù)6周后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩部分，定位航行實(shí)驗(yàn)共歷時(shí)5天用以記錄逃避潛伏期，再于第6天進(jìn)行空間探索試驗(yàn)用以記錄小鼠

5、在自由泳60s內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)。
　　5.電生理學(xué)檢測(cè)
　　小鼠在體海馬LTP實(shí)驗(yàn)于水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行，將小鼠頭部固定于腦立體定位儀上，連接電極并給予適當(dāng)電流刺激，記錄高頻刺激前后群峰電位（population spike，PS）的幅度變化。
　　6. mRNA及蛋白觀察指標(biāo)
　　電生理試驗(yàn)結(jié)束后將小鼠處死，并取其海馬組織，行RT-PCR檢測(cè)海馬NMDAR2B、CaMKII、AMPAR1的mRNA表達(dá)水平；應(yīng)用

6、蛋白免疫印跡法（Western-blot）檢測(cè)細(xì)胞NMDAR2B、CaMKII、AMPAR1的蛋白表達(dá)水平。
　　7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　所有數(shù)據(jù)均使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。逃避潛伏期所得數(shù)據(jù)應(yīng)用重復(fù)測(cè)量方差分析比較?？臻g探索、LTP等實(shí)驗(yàn)記錄數(shù)據(jù)的組間比較應(yīng)用單因素方差分析，兩兩比較采用S-N-K檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.一般情況觀察<

7、br>　　NC組小鼠精神狀態(tài)良好、反應(yīng)靈敏、毛色光亮，進(jìn)食水及尿量均正常；DM組和DM-NBP組小鼠則表現(xiàn)為反應(yīng)遲鈍、少動(dòng)、毛發(fā)稀疏、多尿、多飲及多食等現(xiàn)象。
　　丁苯酞干預(yù)6周后，DM組和DM-NBP組小鼠血糖及體重均明顯高于NC組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。但DM組與DM-NBP組的血糖及體重相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　2.行為學(xué)測(cè)試結(jié)果
　　2.1 定位航行實(shí)驗(yàn)
　　測(cè)試第1天

8、，各組小鼠逃避潛伏期無(wú)明顯差異(P>0.05)；
　　測(cè)試第2-5天，與NC組相比，DM組和DM-NBP組逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05)；而DM-NBP組較DM組逃避潛伏期縮短(P<0.05)。
　　2.2 空間探索實(shí)驗(yàn)
　　三組間小鼠比較，穿越平臺(tái)次數(shù)依次減少：
　　NC組>DM-NBP組>DM組。
　　2.3 基礎(chǔ)游泳速度
　　水迷宮測(cè)試前，讓小鼠進(jìn)行60s的自由泳，結(jié)果顯示DM組與DM-NB

9、P組小鼠間基礎(chǔ)游泳速度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　3.電生理學(xué)檢測(cè)結(jié)果
　　與NC組相比，DM組和DM-NBP組PS幅值明顯降低，LTP受損（P<0.05）；
　　而DM-NBP組較DM組PS幅值增加（P<0.05）；
　　各組間順序表現(xiàn)為：NC組>DM-NBP組>DM組。
　　4.RT-PCR結(jié)果
　　4.1 與NC組相比，DM組和DM-NBP組海馬NMDAR2B mRNA表達(dá)量降低（P<0

10、.05)；而DM-NBP組較DM組海馬NMDAR2B mRNA表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)。
　　4.2 與NC組相比，DM組和DM-NBP組海馬CaMKII mRNA表達(dá)量降低（P<0.05)；而DM-NBP組與DM組相比，海馬CaMKII mRNA表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)。
　　4.3 與NC組相比，DM組和DM-NBP組海馬AMPAR1 mRNA表達(dá)量降低（P<0.05)；而DM-N

11、BP組與DM組相比，海馬AMPAR1 mRNA表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)。
　　5.Western blot結(jié)果
　　5.1 與NC組相比，DM組和DM-NBP組海馬細(xì)胞NMDAR2B蛋白表達(dá)量降低（P<0.05)；而DM-NBP組較DM組海馬細(xì)胞NMDAR2B蛋白表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)。
　　5.2 與NC組相比，DM組和DM-NBP組海馬細(xì)胞CaMKII蛋白表達(dá)量降低（P<0

12、.05)；而DM-NBP組與DM組相比，海馬細(xì)胞CaMKII蛋白表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)。
　　5.3 與NC組相比，DM組和DM-NBP組海馬細(xì)胞AMPAR1蛋白表達(dá)量降低（P<0.05)；而DM-NBP組與DM組相比，海馬細(xì)胞AMPAR1蛋白表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.13周齡的糖尿病db/db小鼠海馬NMDAR-CaMKII-AMPAR的表達(dá)下調(diào)，LTP