孕期邊緣型VA缺乏對(duì)大鼠海馬突觸可塑性鈣信號(hào)通路的影響及可能機(jī)制.pdf

1、維生素A（Vitamin A，VA）是人體必需的重要微量營(yíng)養(yǎng)素，維生素A缺乏（vitamin A deficiency，VAD）在世界范圍內(nèi)廣泛存在，盡管目前國(guó)內(nèi)外對(duì)VA營(yíng)養(yǎng)狀況越來(lái)越重視，但VAD，尤其是容易被人們忽視的可疑亞臨床VAD或邊緣型VAD仍然廣泛存在，而孕婦和兒童又是VAD和可疑亞臨床VAD的高危人群。近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)VA營(yíng)養(yǎng)與學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知功能等有密切聯(lián)系。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)從懷孕開(kāi)始的邊緣型維生素A缺乏（ma

2、rginal Vitamin A deficient group，MVAD）仔鼠，其成年期學(xué)習(xí)記憶功能明顯受損，電刺激誘發(fā)海馬CA1區(qū)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP）水平降低，且強(qiáng)刺激后MVAD組鈣離子濃度明顯低于VAN組。
　　 海馬是與學(xué)習(xí)記憶，尤其空間學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)的重要部位，LTP是突觸可塑性的神經(jīng)電生理基礎(chǔ)，Ca+內(nèi)流入突觸后膜是LTP誘發(fā)的起始信號(hào)。
　　 已有的研究證

3、實(shí)與Ca2+內(nèi)流入突觸后膜相關(guān)的神經(jīng)元膜受體除N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）外，還包括a-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic，AMPAR）受體、酪氨酸激酶B受體（tyrosine kinase B receptor，TrkBR）及代謝型谷氨酸受體（metabot

4、ropic glutamate receptor，mGluR）等。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，孕期MVAD的仔鼠其海馬組織中視黃酸核受體alpha（RARα）及NMDAR、CaM激酶Ⅱ、CBP、Arc等鈣離子依賴(lài)性突觸可塑性信號(hào)分子的表達(dá)均出現(xiàn)降低，同時(shí)，前期研究還發(fā)現(xiàn)，NMDAR1（NR1）與RARα在海馬中存在共定位表達(dá)，提示孕期MVAD可能通過(guò)視黃酸（retinoicacid，RA）-RARα依賴(lài)的信號(hào)途徑損害大鼠海馬中突觸可塑性鈣信號(hào)

5、途徑相關(guān)分子的表達(dá)，并影響鈣離子內(nèi)流，最終損害LTP。
　　 目的：進(jìn)一步探討孕期MVAD對(duì)突觸可塑性相關(guān)鈣信號(hào)途徑中AMPAR、TrKBR、mGluR的影響，以及VA在體內(nèi)的活性代謝產(chǎn)物全反式視黃酸（all-trans retinoic acid，ATRA）對(duì)上述受體在神經(jīng)元中表達(dá)的影響。最后，從電生理角度，探討ATRA對(duì)神經(jīng)元鈣離子濃度調(diào)節(jié)作用、ATRA作用于不同孕期來(lái)源的神經(jīng)元后，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化以及ATRA導(dǎo)致

6、神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子變化可能機(jī)制。
　　 方法：本課題構(gòu)建MVAD孕鼠及雌性幼鼠模型，隨機(jī)分為2組：（1）正常對(duì)照組（VAN組）：母鼠8只，給予維生素A充足飼料（含視黃醇6500IU/kg），生后24h及1周處死；（2）邊緣型維生素A缺乏組：母鼠8只，給予維生素A部分缺乏飼料（VAD飼料，含視黃醇400 IU/kg），生后24h及1周處死；建立孕期MVAD大鼠模型，采用HPLC測(cè)定母鼠、新生大鼠及1周齡大鼠血清中VA濃度，RT-PC

7、R測(cè)定海馬組織中RARs及NMDAR、AMPAR、TrkBR、mGluR mRNA的含量，Western blot測(cè)定RARs及NR1蛋白的水平，以探討孕期VA營(yíng)養(yǎng)對(duì)仔鼠海馬中視黃酸核受體及突觸可塑性鈣離子信號(hào)途徑相關(guān)膜受體的表達(dá)調(diào)節(jié)作用；同時(shí)，采用原代無(wú)血清神經(jīng)元培養(yǎng)方法，建立不同VA營(yíng)養(yǎng)來(lái)源神經(jīng)元細(xì)胞模型，分為ATRA處理組及Control組，免疫熒光技術(shù)鑒定神經(jīng)元細(xì)胞純度，并應(yīng)用該方法對(duì)神經(jīng)元中RARs、NR1表達(dá)定位。RT-PC

8、R測(cè)定海馬組織中RARs及NMDAR、AMPAR、TrkBR、mGluR mRNA的含量，Western blot測(cè)定RARs及NR1蛋白的水平，以進(jìn)一步了解VA營(yíng)養(yǎng)對(duì)突觸可塑性鈣信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)是否是通過(guò)ATRA-RARα信號(hào)途徑依賴(lài)性。最后，探討孕期MVAD對(duì)突觸可塑性鈣信號(hào)途徑中鈣離子內(nèi)流的影響，采用多種分組方法以探討ATRA對(duì)神經(jīng)元鈣離子濃度的影響機(jī)制：1）不同濃度的ATRA處理組：0.5μM、1μM、5μM、10μM、20μM；

9、2）ATRA作用時(shí)間分組：8min、30min、1h、24h；3）建立不同孕期VA營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞模型：MVAD及VAN，觀察神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化；4）依據(jù)神經(jīng)元在體外不同生長(zhǎng)時(shí)間點(diǎn)分組：1d、4d、8d、11d、15d，了解ATRA對(duì)神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子濃度的調(diào)節(jié)與神經(jīng)元的體外生長(zhǎng)時(shí)間關(guān)系；5）通過(guò)細(xì)胞外液無(wú)鈣與含鈣分組，以探討ATRA導(dǎo)致神經(jīng)元鈣離子濃度升高的方式：外鈣內(nèi)流或是胞內(nèi)鈣釋放；6）分別采用RARα、AMPAR及NMDA

10、R拮抗劑預(yù)處理神經(jīng)元1h后，再以ATRA作用神經(jīng)元，探討這些受體在ATRA導(dǎo)致神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子濃度升高中作用。
　　 結(jié)果：1）MVAD組海馬組織中RARα、NR1、AMPR1、TrkBR mRNA的表達(dá)明顯低于VAN組，RARα及NR1在海馬中蛋白水平也明顯低于VAN組，而視黃酸核受體β（RARp）的表達(dá)很低；2）原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolage，NSE）陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)到90

11、％以上，且MVAD組與VAN組比較，兩組NSE陽(yáng)性細(xì)胞率無(wú)明顯差異；3）原代培養(yǎng)8天海馬神經(jīng)元中RARα及NR1明顯表達(dá)，RARα主要表達(dá)于胞漿及突起位置，少部分在細(xì)胞核，NR1則分布于胞漿及突起位置，而RARβ則表達(dá)很低；4）ATRA處理后，原代神經(jīng)元中，RARα及NR1蛋白表達(dá)上調(diào)，AMPAR及TrkBR mRNA表達(dá)上調(diào)；5）ATRA處理后，原代海馬神經(jīng)元中鈣離子濃度明顯升高，不同濃度ATRA處理后，各組鈣離子濃度變化有明顯區(qū)別；

12、ATRA作用不同時(shí)間后，神經(jīng)元鈣離子濃度變化不同；在ATRA作用于體外不同生長(zhǎng)時(shí)間的神經(jīng)元后，其鈣離子濃度變化有顯著差異；進(jìn)一步研究顯示ATRA及NMDA.分別作用于不同孕期VA營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元時(shí)，MAVD組鈣離子升高值明顯低于VAN組；6）RARα選擇性拮抗劑、NMDAR拮抗劑MK801及AMPAR拮抗劑NBQX提前作用神經(jīng)元后，再以ATRA處理時(shí)，鈣離子濃度低于ATRA單獨(dú)作用組。
　　 結(jié)論：1.孕期MVAD降低新生大鼠及1周齡

13、大鼠海馬組織中RARα及NR1mRNA及蛋白水平的表達(dá)，ATRA能升高神經(jīng)元中RARα及NR1mRNA及蛋白水平表達(dá)，提示VA能通過(guò)RA-RARα信號(hào)通路調(diào)節(jié)NMDAR表達(dá)，電生理結(jié)果提示孕期MVAD抑制ATRA及NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)元鈣離子內(nèi)流，表明孕期MVAD能通過(guò)RA-RARα信號(hào)通路調(diào)節(jié)NMDAR表達(dá)，進(jìn)而影響神經(jīng)元鈣離子內(nèi)流，這可能是VA營(yíng)養(yǎng)影響突觸可塑性鈣信號(hào)通路的重要機(jī)制之一。
　　 2.孕期MVAD對(duì)新生大鼠及1周

14、齡大鼠海馬組織AMPAR、TrkBRmRNA表達(dá)降低，ATRA能升高神經(jīng)元中AMPAR及TrkBRmRNA的表達(dá)，提示VA能通過(guò)RA信號(hào)通路調(diào)節(jié)上述受體表達(dá)，這可能是VA營(yíng)養(yǎng)影響突觸可塑性鈣信號(hào)通路的另一重要機(jī)制。
　　 3.ATRA會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元中鈣離子濃度的內(nèi)流，而RARα選擇性拮抗劑、NMDAR及AMPAR的拮抗劑能分別部分阻斷ATRA的作用，提示RARα、NMDAR及AMPAR在ATRA導(dǎo)致神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子濃度中發(fā)揮重要作