糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力障礙的突觸可塑性機(jī)制研究.pdf

1、目的：糖尿病對(duì)記憶功能的影響是重要的醫(yī)學(xué)問題。本論文以SD大鼠為研究對(duì)象，在學(xué)習(xí)和記憶的行為學(xué)層次及學(xué)習(xí)記憶關(guān)鍵腦區(qū)(海馬PP-DG通路)的突觸可塑性層次上，研究糖尿病降低大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的突觸可塑性機(jī)制。從大鼠空間記憶能力的行為學(xué)特征，大鼠海馬前穿通纖維-齒狀回(PP-DG)通路的突觸可塑性變化，包括長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term Potentiation，LTP)、長(zhǎng)時(shí)程抑制(long-term Depression，LTD)及雙脈

2、沖易化(paired pulse facility，PPF)等，探討糖尿病大鼠空間記憶能力的降低及其突觸可塑性機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠70只，起始體重(180±20)g。
　　 2.把SD大鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組(Control)，STZ誘導(dǎo)糖尿病組和高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合STZ誘導(dǎo)糖尿病組。應(yīng)用鏈脲佐菌素(STZ)一次性腹腔注射和聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)的方法分別制備模擬類似1型和2型糖尿病大鼠模型

3、。其中對(duì)照組10只，2個(gè)模型組各30只。
　　 3.將3組大鼠分別進(jìn)行Morris水迷宮學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)測(cè)試，分別研究?jī)煞N造模方法導(dǎo)致的糖尿病對(duì)大鼠空間記憶能力和空間關(guān)聯(lián)記憶能力的影響。
　　 (1)定位航行實(shí)驗(yàn)：3組大鼠連續(xù)訓(xùn)練4天。每個(gè)時(shí)間段大鼠分別從水迷宮的第Ⅰ、第Ⅱ、第Ⅲ坐標(biāo)象限內(nèi)標(biāo)定的入水點(diǎn)入水，學(xué)習(xí)尋找沒于水面以下的平臺(tái)。
　　 (2)空間探索實(shí)驗(yàn)：撤去平臺(tái)，將大鼠從已訓(xùn)練過的第Ⅰ象限入水點(diǎn)將3組大鼠逐

4、個(gè)放入水中，記錄其在120s內(nèi)運(yùn)動(dòng)軌跡及相應(yīng)參數(shù)。
　　 (3)空間關(guān)聯(lián)記憶能力實(shí)驗(yàn)：撤去平臺(tái)，從沒有訓(xùn)練過的第Ⅳ象限的入水點(diǎn)分別將3組大鼠逐個(gè)放入水中，記錄其在120s內(nèi)運(yùn)動(dòng)軌跡及相應(yīng)參數(shù)。
　　 4.水迷宮測(cè)試后，分別從2個(gè)糖尿病模型組中選出空間記憶能力較差的15只大鼠，和對(duì)照組同時(shí)進(jìn)行海馬PP-DG通路的LTP、LTD、PPF測(cè)試實(shí)驗(yàn)。
　　 (1)大鼠用烏拉坦麻醉后頭部固定于立體定位儀。將刺激電極置于大鼠

5、內(nèi)嗅區(qū)前穿通纖維(PP)，記錄電極置于海馬齒狀回(DG)。刺激信號(hào)從刺激器輸出，經(jīng)隔離器到達(dá)刺激電極，記錄電極記錄細(xì)胞外場(chǎng)興奮性突觸后電位(fEPSP)及突觸后群峰電位(PPS)，信號(hào)經(jīng)過膜片鉗放大器。測(cè)定輸入/輸出(I/O)曲線。
　　 (2)配對(duì)易化(PPF)記錄：選擇誘發(fā)50％最大群峰電位(PS)幅值的刺激強(qiáng)度為條件刺激(CS)強(qiáng)度。PS穩(wěn)定20 min后，用雙脈沖進(jìn)行刺激，間隔30-100ms，波寬150μs，頻率0.5

6、 Hz，刺激強(qiáng)度為條件刺激強(qiáng)度。每個(gè)間隔記錄5次，計(jì)算PS2與PS1比值。
　　 (3)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)記錄：PS穩(wěn)定后，CS刺激并記錄30min，作為基線(baseline)。LTP實(shí)驗(yàn)時(shí)，進(jìn)行高頻刺激(high frequency stimulus，HFS)，20個(gè)200Hz的脈沖為一組，間隔2s，共10組，強(qiáng)度為誘發(fā)75％最大PS幅值的刺激強(qiáng)度。HFS后，改用條件刺激并記錄60min。
　　 (4)長(zhǎng)時(shí)程抑制(

7、LTD)記錄：PS穩(wěn)定后，CS刺激并記錄30min，作為基線(baseline)。LTD實(shí)驗(yàn)時(shí)，進(jìn)行低頻刺激(low frequency stimulus，LFS)，900個(gè)1 Hz的串刺激，每個(gè)串為250 Hz的5個(gè)脈沖，刺激強(qiáng)度為CS強(qiáng)度。LFS后，改用條件刺激并記錄60min。
　　 (5)分析討論糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的降低及其突觸可塑性機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　　 1.糖尿病大鼠模型的驗(yàn)證：
　　

8、 造模后的第3、7、14、28天檢測(cè)兩個(gè)糖尿病模型組的空腹血糖值，均大于16.7mmol/L，STZ誘導(dǎo)糖尿病組28天時(shí)血糖平均值為26.40±3.55(n=30)，高脂喂養(yǎng)聯(lián)合STZ誘導(dǎo)組為24.85±5.34(n=30)。
　　 2.Morris水迷宮學(xué)習(xí)記憶能力行為學(xué)：
　　 (1)糖尿病造模1個(gè)月后，糖尿病組大鼠和正常對(duì)照組的空間記憶和空間關(guān)聯(lián)記憶能力的比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 (2)糖尿病造模3個(gè)月后

9、，在定位航行實(shí)驗(yàn)中，兩個(gè)糖尿病組大鼠的逃避潛伏期都比對(duì)照組時(shí)間長(zhǎng)，Control組第4天的平均值為7.90±3.58(n=30)，STZ誘導(dǎo)組為19.02±2.15(n=30)，高脂喂養(yǎng)聯(lián)合STZ誘導(dǎo)組為20.69±3.02(n=30)，模型組與對(duì)照組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)第2天開始，對(duì)照組逃避潛伏期的下降趨勢(shì)明顯，而糖尿病組下降緩慢。
　　 (3)糖尿病造模3個(gè)月后，在空間探索實(shí)驗(yàn)中，從訓(xùn)練過的Ⅰ象限入水時(shí)，兩個(gè)

10、糖尿病模型組平臺(tái)象限游泳時(shí)間短，第1環(huán)點(diǎn)數(shù)和總得分低，STZ誘導(dǎo)組這三項(xiàng)參數(shù)值分別為43.76±10.38(n=30)，5.33±2.27(n=30)，2372.11±187.23(n=30)；高脂喂養(yǎng)聯(lián)合 STZ誘導(dǎo)組三項(xiàng)參數(shù)值分別為40.88±14.56(n=30)，4.85±2.86(n=30)，2081.67±195.18(n=30)。而Control組三項(xiàng)參數(shù)分別為：69.77±12.36(n=30)，11.36±2.78(n

11、=30)，3172.74±250.80(n=30)；模型組與對(duì)照組的差異具有統(tǒng)計(jì)意義(p<0.05)。
　　 從未訓(xùn)練的Ⅳ象限入水時(shí)，平臺(tái)象限游泳時(shí)間、第1環(huán)點(diǎn)數(shù)和總得分為：STZ誘導(dǎo)組38.82±9.63(n=30)，4.86±2.15(n=30)，2015.98±206.33(n=30)；高脂喂養(yǎng)聯(lián)合STZ誘導(dǎo)組40.67±11.95(n=30)，5.31±2.26(n=30)，2206.85±157.40(n=30)；Co

12、ntrol組62.64±10.78(n=30)，10.57±2.96(n=30)，2912.63±191.39(n=30)。糖尿病模型組的參數(shù)值也均低于正常對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，而且STZ誘導(dǎo)的糖尿病組的總得分比高脂喂養(yǎng)聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的糖尿病組更低一些。
　　 3.海馬PP-DG通路的突觸可塑性
　　 (1)I/O曲線波形：對(duì)照組50％最大反應(yīng)波形對(duì)應(yīng)強(qiáng)度為0.35mA，STZ誘導(dǎo)組50％最大反應(yīng)波形對(duì)

13、應(yīng)強(qiáng)度為0.45mA，高脂喂養(yǎng)聯(lián)合STZ誘導(dǎo)組50％最大反應(yīng)波形對(duì)應(yīng)強(qiáng)度為0.41mA。糖尿病模型組I/O曲線均整體向下、向右移動(dòng)，并且STZ誘導(dǎo)組的I/O曲線與高脂喂養(yǎng)聯(lián)合STZ誘導(dǎo)組相比，和對(duì)照組的距離更遠(yuǎn)。
　　 (2)配對(duì)易化(PPF)：Control組增強(qiáng)起始點(diǎn)為35ms，高脂喂養(yǎng)聯(lián)合STZ誘導(dǎo)組為37ms，STZ誘導(dǎo)組為42ms。3組大鼠的易化強(qiáng)度分別為：Control組(204.80±14.57)％(n=8)，高脂

14、喂養(yǎng)聯(lián)合STZ組(181.79±13.81)％(n=7)，STZ誘導(dǎo)組(172.684±15.02)％(n=7)。在脈沖間隔30-100ms內(nèi)，雙脈沖易化寬度分別為Control組65ms，高脂喂養(yǎng)聯(lián)合STZ組63ms，STZ誘導(dǎo)組58ms。可以看出，糖尿病模型組較正常對(duì)照組雙脈沖易化強(qiáng)度降低，易化寬度減小，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。STZ誘導(dǎo)組的雙脈沖易化強(qiáng)度更低一些。
　　 (3)LTP：高頻刺激后60min時(shí)，Con

15、trol組與高脂喂養(yǎng)聯(lián)合STZ組、STZ誘導(dǎo)組的 PS幅值分別為條件刺激 PS幅值的(258.93±22.45)％(n=7)，(203.674±19.86)％(n=6)，(160.12±17.91)％(n=6)；高脂喂養(yǎng)聯(lián)合STZ組LTP比Control組降低55.26％，STZ誘導(dǎo)組LTP比Control組降低98.81％，模型組與對(duì)照有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，并且STZ誘導(dǎo)糖尿病組降低得更多。
　　 (4)LTD：低頻刺

16、激后60 min時(shí)，Control組與高脂喂養(yǎng)聯(lián)合STZ組、STZ誘導(dǎo)組的 PS幅值分別為條件刺激PS幅值的(106.35±3.51)％(n=6)，(81.92±9.96)％(n=5)，(67.73±4.35)％(n=5)。結(jié)果顯示糖尿病模型組LTD易化，模型組與對(duì)照組有顯著差異(p<0.05)。高脂喂養(yǎng)聯(lián)合STZ組 PS幅值較Control組減幅為24.43％，STZ誘導(dǎo)組的PS幅值比Control組減少38.62％，可見STZ誘導(dǎo)的

17、糖尿病組LTD易化的幅度比高脂喂養(yǎng)聯(lián)合STZ誘導(dǎo)糖尿病組更大。
　　 (5)突觸可塑性范圍：Control組為152.58％(n=6)，高脂喂養(yǎng)聯(lián)合STZ組的突觸可塑性范圍是121.75％(n=5)，STZ誘導(dǎo)組突觸可塑性范圍為92.39％(n=5)。由此可見，糖尿病降低了大鼠海馬PP-DG通路的突觸可塑性范圍，其中STZ誘導(dǎo)的糖尿病組大鼠突觸可塑性遭到的破壞更大，所以突觸可塑性的范圍更小。
　　 結(jié)論：本論文研究糖尿病

18、降低大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的突觸可塑性機(jī)制。通過大鼠水迷宮空間記憶能力的行為學(xué)和海馬PP-DG通路的突觸可塑性研究，得出主要結(jié)論如下：
　　 1.糖尿病對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)的影響
　　 (1)通過Morris水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)說明，經(jīng)過一定時(shí)間后，糖尿病會(huì)導(dǎo)致大鼠發(fā)生空間記憶能力和空間關(guān)聯(lián)記憶能力的下降。
　　 (2)相比高脂喂養(yǎng)聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠來說，STZ誘導(dǎo)的糖尿病組大鼠空間關(guān)聯(lián)記憶能力可能受到的影響更

19、大。
　　 2.糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶下降的突觸可塑性機(jī)制
　　 (1)患糖尿病后，大鼠海馬PP-DG區(qū)的I/O曲線下移，相同強(qiáng)度引起的突觸后反應(yīng)波形 PS幅值減小，說明糖尿病使得突觸傳遞效能降低。
　　 (2)患糖尿病后，大鼠海馬雙脈沖易化強(qiáng)度受到顯著抑制，雙脈沖易化的間隔范圍縮短。提示糖尿病影響大鼠海馬PP-DG短時(shí)程突觸可塑性可能是通過抑制突觸前神經(jīng)遞質(zhì)的釋放來實(shí)現(xiàn)的。
　　 (3)STZ誘導(dǎo)和高脂喂養(yǎng)