基于miRNAs介導突觸可塑性探討電針改善缺血性腦卒中模型大鼠學習記憶功能的作用機制.pdf

1、目的：
　　探討電針“百會”、“神庭”穴對缺血性腦卒中模型大鼠學習記憶功能以及靜息態(tài)功能磁共振成像（resting-state functional magnetic resonance imaging，rs-fMRI）的影響。在神經(jīng)影像學的基礎之上，探討腦區(qū)突觸結構和功能的可塑性變化，并進一步基于microRNA(miRNA)組學探討其分子生物學機制。
　　方法：
　　1.根據(jù)隨機數(shù)字表法:將SPF級雄性spragu

2、e dawley(SD)大鼠隨機分為假手術組和缺血性腦卒中造模組，然后依據(jù)干預前神經(jīng)功能缺損評分和行為學結果將大鼠隨機分為3組，模型組、電針組和非穴組。
　　2.復制缺血性腦卒中大鼠模型，術后第2天開始取“百會”、“神庭”穴及非經(jīng)非穴實施電針干預，電壓峰值為6V，疏密波，頻率2/20 Hz，每次治療30min，1次/天，共14天;
　　3.干預前后各組大鼠采用跳臺實驗檢測其學習記憶功能;干預后采用Morris水迷宮檢測其空間

3、學習記憶能力;
　　4.采用小動物rs-fMRI掃描以及腦區(qū)BOLD信號局部一致性(regional homogeneity，ReHo)分析各組大鼠神經(jīng)細胞活動變化;
　　5.采用高爾基染色(Golgi)觀察各組大鼠神經(jīng)突觸和樹突棘形態(tài)變化，以及場電位電生理檢測各組大鼠長時程增強（long-term potentiation，LTP）反應;
　　6.采用Western blotting法檢測學習記憶相關蛋白的表達和磷酸

4、化水平;
　　7.采用miRNA芯片檢測miRNAs的差異表達，以及靶基因預測和信號轉(zhuǎn)導通路分析，實時熒光定量PCR法驗證miRNA表達水平。
　　結果：
　　1.本研究發(fā)現(xiàn)干預前，模型組、電針組和非穴組跳臺實驗觀察的學習記憶行為學三組之間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);干預后，電針組相對模型組、非穴組大鼠跳臺實驗和Morris水迷宮觀察的潛伏期縮短(P＜0.05)。
　　2.采用T2WI發(fā)現(xiàn)缺血性模型大鼠海馬、內(nèi)

5、嗅皮層、運動皮層、感覺皮層、背側丘腦和紋狀體等腦區(qū)出現(xiàn)梗死，而電針“百會”、“神庭”穴減少其腦區(qū)梗死體積(P＜0.05);
　　3.對各組大鼠進行rs-fMRI分析，發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中模型大鼠BOLD信號局部一致性降低的腦區(qū)包括雙側杏仁核、雙側海馬、雙側內(nèi)嗅皮層、雙側島葉皮層、雙側梨狀皮質(zhì)、雙側感覺皮層、雙側運動皮層、雙側扣帶回、雙側背側丘腦、左側聽覺皮層和左側紋狀體(P＜0.005)。而電針干預后雙側杏仁核、雙側海馬、右側島葉皮層

6、、雙側內(nèi)嗅皮層、右側梨狀皮層和右側感覺皮層BOLD信號局部一致性升高(P＜0.005);非穴干預后左側杏仁核、左側梨狀皮質(zhì)和左側紋狀體BOLD信號局部一致性升高(P＜0.005);
　　4.選擇學習記憶相關腦區(qū)海馬CA1、內(nèi)嗅皮層進一步分析其突觸可塑性變化，低倍視野下顯示缺血性腦卒中模型大鼠海馬CA1、內(nèi)嗅皮層樹突棘脫落、萎縮，排列紊亂;而電針治療后其病理損傷程度緩解。高倍視野下電針治療后缺血性腦卒中模型大鼠樹突棘的分支、數(shù)量和密

7、度均增加（P＜0.05）;
　　5.突觸功能可塑性檢測發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中模型大鼠在HFS誘導后缺血側海馬CA3-CA1和內(nèi)嗅皮層-海馬CA1的興奮性突觸后電位(fEPSP)斜率的百分比均下降(P＜0.05);而電針治療后其fEPSP斜率的百分比增加(P＜0.05)，突觸后膜相關學習記憶蛋白AMPA受體、NMDA受體的磷酸化水平升高(P＜0.05);
　　6.缺血側海馬CA1和內(nèi)嗅皮層進行miRNA芯片分析顯示:缺血側海馬CA1

8、差異表達≥1.5 miRNAs共48個miRNAs(P＜0.05)，其中36個miRNAs表達下調(diào)，12個miRNAs表達上調(diào);缺血側內(nèi)嗅皮層差異表達≥1.5 miRNAs共90個(P＜0.05)，其中70個miRNAs表達下調(diào)，20個miRNAs表達上調(diào);其中rno-miR-668和rno-miR-3084b-5p在缺血側海馬CA1和內(nèi)嗅皮層均表達上調(diào);而rno-miR-28，rno-miR-10a，rno-miR-let-7b，rn

9、o-miR-425，rno-miR-7b，rno-miR-154，rno-miR-540,rno-miR-let-7f-2，rno-miR-186，rno-miR-219a，rno-miR-3072，rno-miR-344a,rno-miR-190b，rno-miR-100，rno-miR-92a的表達水平在兩個腦區(qū)均下調(diào);
　　7.對以上缺血側海馬CA1和內(nèi)嗅皮層表達均上調(diào)和下調(diào)的miRNAs進行靶基因預測和信號轉(zhuǎn)導通路分析，發(fā)

10、現(xiàn)富集分高的cGMP-PKG信號通路(P＜0.05)與學習記憶功能密切相關，通過生物信息學預測和體外證實miR-219a負調(diào)控cGMP-PKG信號通路關鍵節(jié)點PRKG2靶基因(P＜0.01);
　　8.對miR-219a進行在體功能分析，發(fā)現(xiàn)miR-219a mimics可以阻斷電針“百會”、“神庭”穴下調(diào)miR-219a的表達水平，并影響PRKG2下游CREB的磷酸化，進而減少學習記憶即刻早期基因c-fos和c-jun的蛋白表達

11、(P＜0.05)。
　　結論：
　　1.電針“百會”、“神庭”穴治療缺血性腦卒中模型大鼠14天，提高大鼠學習記憶能力，減少海馬、內(nèi)嗅皮層的梗死體積，增強海馬、內(nèi)嗅皮層BOLD信號局部一致性，提示腦卒中模型大鼠學習記憶能力的改善與海馬、內(nèi)嗅皮層結構和功能損傷的修復相關。
　　2.電針“百會”、“神庭”穴促進缺血性腦卒中模型大鼠缺血側海馬、內(nèi)嗅皮層樹突棘形態(tài)的修復和易化海馬CA3-CA1和內(nèi)嗅皮層-海馬CA1的LTP反應，