基于miRNAs介導(dǎo)突觸可塑性探討電針改善缺血性腦卒中模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的作用機制.pdf

1、目的：
　　探討電針“百會”、“神庭”穴對缺血性腦卒中模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能以及靜息態(tài)功能磁共振成像（resting-state functional magnetic resonance imaging，rs-fMRI）的影響。在神經(jīng)影像學(xué)的基礎(chǔ)之上，探討腦區(qū)突觸結(jié)構(gòu)和功能的可塑性變化，并進一步基于microRNA(miRNA)組學(xué)探討其分子生物學(xué)機制。
　　方法：
　　1.根據(jù)隨機數(shù)字表法:將SPF級雄性spragu

2、e dawley(SD)大鼠隨機分為假手術(shù)組和缺血性腦卒中造模組，然后依據(jù)干預(yù)前神經(jīng)功能缺損評分和行為學(xué)結(jié)果將大鼠隨機分為3組，模型組、電針組和非穴組。
　　2.復(fù)制缺血性腦卒中大鼠模型，術(shù)后第2天開始取“百會”、“神庭”穴及非經(jīng)非穴實施電針干預(yù)，電壓峰值為6V，疏密波，頻率2/20 Hz，每次治療30min，1次/天，共14天;
　　3.干預(yù)前后各組大鼠采用跳臺實驗檢測其學(xué)習(xí)記憶功能;干預(yù)后采用Morris水迷宮檢測其空間

3、學(xué)習(xí)記憶能力;
　　4.采用小動物rs-fMRI掃描以及腦區(qū)BOLD信號局部一致性(regional homogeneity，ReHo)分析各組大鼠神經(jīng)細胞活動變化;
　　5.采用高爾基染色(Golgi)觀察各組大鼠神經(jīng)突觸和樹突棘形態(tài)變化，以及場電位電生理檢測各組大鼠長時程增強（long-term potentiation，LTP）反應(yīng);
　　6.采用Western blotting法檢測學(xué)習(xí)記憶相關(guān)蛋白的表達和磷酸

4、化水平;
　　7.采用miRNA芯片檢測miRNAs的差異表達，以及靶基因預(yù)測和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析，實時熒光定量PCR法驗證miRNA表達水平。
　　結(jié)果：
　　1.本研究發(fā)現(xiàn)干預(yù)前，模型組、電針組和非穴組跳臺實驗觀察的學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)三組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);干預(yù)后，電針組相對模型組、非穴組大鼠跳臺實驗和Morris水迷宮觀察的潛伏期縮短(P＜0.05)。
　　2.采用T2WI發(fā)現(xiàn)缺血性模型大鼠海馬、內(nèi)

5、嗅皮層、運動皮層、感覺皮層、背側(cè)丘腦和紋狀體等腦區(qū)出現(xiàn)梗死，而電針“百會”、“神庭”穴減少其腦區(qū)梗死體積(P＜0.05);
　　3.對各組大鼠進行rs-fMRI分析，發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中模型大鼠BOLD信號局部一致性降低的腦區(qū)包括雙側(cè)杏仁核、雙側(cè)海馬、雙側(cè)內(nèi)嗅皮層、雙側(cè)島葉皮層、雙側(cè)梨狀皮質(zhì)、雙側(cè)感覺皮層、雙側(cè)運動皮層、雙側(cè)扣帶回、雙側(cè)背側(cè)丘腦、左側(cè)聽覺皮層和左側(cè)紋狀體(P＜0.005)。而電針干預(yù)后雙側(cè)杏仁核、雙側(cè)海馬、右側(cè)島葉皮層

6、、雙側(cè)內(nèi)嗅皮層、右側(cè)梨狀皮層和右側(cè)感覺皮層BOLD信號局部一致性升高(P＜0.005);非穴干預(yù)后左側(cè)杏仁核、左側(cè)梨狀皮質(zhì)和左側(cè)紋狀體BOLD信號局部一致性升高(P＜0.005);
　　4.選擇學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)海馬CA1、內(nèi)嗅皮層進一步分析其突觸可塑性變化，低倍視野下顯示缺血性腦卒中模型大鼠海馬CA1、內(nèi)嗅皮層樹突棘脫落、萎縮，排列紊亂;而電針治療后其病理損傷程度緩解。高倍視野下電針治療后缺血性腦卒中模型大鼠樹突棘的分支、數(shù)量和密

7、度均增加（P＜0.05）;
　　5.突觸功能可塑性檢測發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中模型大鼠在HFS誘導(dǎo)后缺血側(cè)海馬CA3-CA1和內(nèi)嗅皮層-海馬CA1的興奮性突觸后電位(fEPSP)斜率的百分比均下降(P＜0.05);而電針治療后其fEPSP斜率的百分比增加(P＜0.05)，突觸后膜相關(guān)學(xué)習(xí)記憶蛋白AMPA受體、NMDA受體的磷酸化水平升高(P＜0.05);
　　6.缺血側(cè)海馬CA1和內(nèi)嗅皮層進行miRNA芯片分析顯示:缺血側(cè)海馬CA1

8、差異表達≥1.5 miRNAs共48個miRNAs(P＜0.05)，其中36個miRNAs表達下調(diào)，12個miRNAs表達上調(diào);缺血側(cè)內(nèi)嗅皮層差異表達≥1.5 miRNAs共90個(P＜0.05)，其中70個miRNAs表達下調(diào)，20個miRNAs表達上調(diào);其中rno-miR-668和rno-miR-3084b-5p在缺血側(cè)海馬CA1和內(nèi)嗅皮層均表達上調(diào);而rno-miR-28，rno-miR-10a，rno-miR-let-7b，rn

9、o-miR-425，rno-miR-7b，rno-miR-154，rno-miR-540,rno-miR-let-7f-2，rno-miR-186，rno-miR-219a，rno-miR-3072，rno-miR-344a,rno-miR-190b，rno-miR-100，rno-miR-92a的表達水平在兩個腦區(qū)均下調(diào);
　　7.對以上缺血側(cè)海馬CA1和內(nèi)嗅皮層表達均上調(diào)和下調(diào)的miRNAs進行靶基因預(yù)測和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析，發(fā)

10、現(xiàn)富集分高的cGMP-PKG信號通路(P＜0.05)與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)，通過生物信息學(xué)預(yù)測和體外證實miR-219a負調(diào)控cGMP-PKG信號通路關(guān)鍵節(jié)點PRKG2靶基因(P＜0.01);
　　8.對miR-219a進行在體功能分析，發(fā)現(xiàn)miR-219a mimics可以阻斷電針“百會”、“神庭”穴下調(diào)miR-219a的表達水平，并影響PRKG2下游CREB的磷酸化，進而減少學(xué)習(xí)記憶即刻早期基因c-fos和c-jun的蛋白表達

11、(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.電針“百會”、“神庭”穴治療缺血性腦卒中模型大鼠14天，提高大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，減少海馬、內(nèi)嗅皮層的梗死體積，增強海馬、內(nèi)嗅皮層BOLD信號局部一致性，提示腦卒中模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善與海馬、內(nèi)嗅皮層結(jié)構(gòu)和功能損傷的修復(fù)相關(guān)。
　　2.電針“百會”、“神庭”穴促進缺血性腦卒中模型大鼠缺血側(cè)海馬、內(nèi)嗅皮層樹突棘形態(tài)的修復(fù)和易化海馬CA3-CA1和內(nèi)嗅皮層-海馬CA1的LTP反應(yīng)，