發(fā)育期大鼠視皮層突觸功能活動及脈沖時間依賴的突觸可塑性研究.pdf

1、目的： 本文通過建立可視法腦片膜片鉗技術(shù)，研究發(fā)育期大鼠視皮層突觸功能活動以及發(fā)育期大鼠視皮層脈沖時間依賴的突觸可塑性（spike timing-dependent plasticity，STDP），了解視皮層經(jīng)驗(yàn)依賴的突觸可塑性，進(jìn)一步探索視覺經(jīng)驗(yàn)在視皮層神經(jīng)元突觸發(fā)育成熟過程中的作用，以及在異常視覺經(jīng)驗(yàn)狀態(tài)下視皮層突觸功能狀態(tài)的改變，從功能的角度來探索弱視發(fā)生機(jī)制，為尋求合理有效的預(yù)防與治療弱視的方法建立基礎(chǔ)。 方法

2、： 1．應(yīng)用紅外微分干涉相差顯微鏡（IR-DIC）結(jié)合電耦合式攝像機(jī)（CCD-Camera）可視法膜片鉗全細(xì)胞記錄生后2～7 d、8～14 d、15～21 d、22～28d各組自發(fā)興奮性突觸后電流（spontaneous excitatory postsynaptic currents，sEPSCs）變化，同時于電極內(nèi)液中加入0．3%熒光黃（luciferyellow）對所記錄細(xì)胞進(jìn)行染色觀察形態(tài)學(xué)改變，分別記錄17 d（正常飼

3、養(yǎng)組及雙眼剝奪組）大鼠腦片的sEPSCs并行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 2．在較低頻率細(xì)胞內(nèi)刺激下應(yīng)用雙膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)，觀察在不同的配對刺激方案下，大鼠腦片視皮質(zhì)2/3層內(nèi)兩錐體神經(jīng)元突觸傳遞效能的長時程變化情況。同時通過電極內(nèi)液加入熒光染料觀察細(xì)胞與突觸形態(tài)。 3．采用STDP模式，應(yīng)用雙膜片鉗技術(shù)，對雙眼剝奪組和對照組的興奮性突觸后電位基線值（control EPSP）進(jìn)行測量，統(tǒng)計(jì)平均EPSP幅值，觀察突觸傳遞效能變化。在

4、精確控制突觸前和突觸后神經(jīng)元刺激時間下，采用不同的突觸前后配對刺激方案對EPSP變化進(jìn)行測量，觀察雙眼剝奪組和對照組的區(qū)別。同時采用傳統(tǒng)的長時程增強(qiáng)（LTP）誘導(dǎo)方式（僅給予突觸前脈沖刺激），采取頻率由低到高，并逐漸接近近似θ波刺激頻率（theta-burst stimulation，TBS），逐一觀察不同頻率下EPSP變化。 結(jié)果： 1．可視法腦片膜片鉗技術(shù)可對神經(jīng)元直接進(jìn)行準(zhǔn)確定位及健康細(xì)胞的篩選。視皮層神經(jīng)元sEP

5、SCs幅值與頻率均隨發(fā)育逐漸升高，（單因素方差分析，頻率F=87．46，幅值F=20．69，P<0．01詳見第一部分結(jié)果）。但2～7 d組與8～14 d組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）。視皮層2/3層神經(jīng)元胞體及突起以及生物電學(xué)特性隨發(fā)育逐漸成熟。雙眼剝奪組和健康對照組的sEPSCs比較，幅值下降明顯P<0．05，頻率比較差異無顯著意義P>0．05。 2．精確控制突觸前和突觸后神經(jīng)元刺激時間下，突觸前后配對刺激后測試突觸后動作

6、電位（test EPSP）平均增幅在120%以上，LTP誘導(dǎo)成功。而只有突觸前或只有突觸后刺激，test EPSP平均增幅在110%以下，LTP未誘導(dǎo)成功。 3．雙眼剝奪組視皮層2/3層內(nèi)兩相鄰錐體神經(jīng)元之間的突觸傳遞效能下降。剝奪組與對照組平均EPSP幅值（基線值）比較差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．01）。配對誘導(dǎo)刺激50分后，雙眼剝奪組EPSP幅值上升幅度較對照組高，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0．05，兩組均可誘導(dǎo)成功LT

7、P。而采用傳統(tǒng)的LTP誘導(dǎo)方法低頻刺激，24例均未誘導(dǎo)出LTP。逐漸增加頻率，EPSP增幅也隨之略增加，但即使頻率增加到100Hz左右近似TBS刺激頻率時，EPSP平均增幅也不能達(dá)到110%以上。 結(jié)論： 1．可視法腦片膜片鉗技術(shù)操作更直觀方便，對神經(jīng)元的分辨率及封接細(xì)胞的成功率都大大提高。生后早期視皮層2/3層神經(jīng)元及突觸發(fā)育處于相對不成熟狀態(tài)，隨著發(fā)育逐漸成熟，視覺經(jīng)驗(yàn)在這一過程中起了關(guān)鍵性作用。研究顯示發(fā)育早期突觸

8、并非完全處于靜息狀態(tài)，具有一定的早期自發(fā)的突觸功能活動。 2．突觸傳遞效能的變化依賴于突觸前后的聯(lián)合脈沖刺激，脈沖時間前與后的順序設(shè)定決定了突觸傳遞效能變化的方向。突觸前后脈沖刺激對突觸傳遞效能的變化存在一個時間窗關(guān)系，STDP突觸修飾法則可以解釋經(jīng)驗(yàn)活動改變皮層神經(jīng)元功能的一些現(xiàn)象。 3．外界視覺經(jīng)驗(yàn)異?；蚴艿礁蓴_時，影響了視皮質(zhì)神經(jīng)元信息呈遞，下降的信息傳遞可能間接影響了高級中樞的信息整合。但發(fā)育期雙眼剝奪的視皮層神