葡萄籽原花青素B2對(duì)db-db小鼠主動(dòng)脈保護(hù)機(jī)制的研究.pdf

1、第一章GSPB2對(duì)db/db小鼠主動(dòng)脈保護(hù)作用的蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　 研究背景:
　　 糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種由于胰島素抵抗伴有相對(duì)胰島素不足或胰島素分泌缺陷而導(dǎo)致的以慢性血葡萄糖水平增高為特征的代謝性疾病。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，生活方式的改變和社會(huì)人口老齡化，糖尿病患病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，已經(jīng)成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后的又一嚴(yán)重危害人類健康的全球公共衛(wèi)生問題，

2、也成為世界各國(guó)致死、致殘并造成醫(yī)療開支增高的主要原因。糖尿病不僅以持續(xù)性的高血糖為其特點(diǎn)，更重要的是高血糖以及合并的代謝紊亂引起的多系統(tǒng)損害，諸如心臟、血管、腎臟、神經(jīng)、視網(wǎng)膜、周圍神經(jīng)、腦等組織器官的慢性進(jìn)行性病變。
　　 糖尿病主動(dòng)脈病變是糖尿病最常見的大血管并發(fā)癥，是糖尿病患者的主要死因。糖尿病患者比非糖尿病患者發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化及其并發(fā)癥的危險(xiǎn)提高了2-4倍，糖尿病已經(jīng)作為冠心病等危癥越來(lái)越受到人們的重視。糖尿病主動(dòng)脈病變

3、以不斷進(jìn)展的動(dòng)脈粥樣硬化及血管重構(gòu)為特征，是糖尿病心血管并發(fā)癥的主要病理學(xué)基礎(chǔ)。其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，治療手段也不完善。因此，在臨床實(shí)踐中迫切需要尋找糖尿病主動(dòng)脈病變的內(nèi)在分子機(jī)制與新型治療藥物，進(jìn)一步完善與充實(shí)DM主動(dòng)脈病變的治療策略。
　　 天然藥物葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidin extract，GSPE）是從葡萄籽中提取的一種天然多酚類化合物，主要是以兒茶素或表兒茶素為單體縮合而成的聚

4、合物，其中以低聚體（二聚、三聚、四聚體）生物活性最強(qiáng)。葡萄籽原花青素B2(GSPB2)是GSPE的主要成分，其生物活性在GSPE的多種成分中最強(qiáng)。有研究表明，GSPB2具有抗炎、抗凋亡、抗AGEs誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的作用。既往研究表明，GSPE對(duì)鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的主動(dòng)脈具有明確的保護(hù)作用。然而，此保護(hù)作用的分子機(jī)制還不完全清楚。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一種基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組

5、定量分析技術(shù)即同位素標(biāo)記的相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)(isobaric tag for relative and absolutequantitation，iTRAQ)以其獨(dú)特的優(yōu)越性，正逐漸成為定量研究中的主要方法之一。iTRAQ技術(shù)可對(duì)一個(gè)基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)或一個(gè)復(fù)雜的混合體系中的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行精確定量和鑒定，尋找差異表達(dá)蛋白，并分析其蛋白功能。其已經(jīng)在探討疾病發(fā)生機(jī)制、疾病標(biāo)志物的尋找和不同時(shí)段或者不同狀態(tài)的多樣本定量分析等蛋白質(zhì)組學(xué)

6、研究領(lǐng)域得到了很好的應(yīng)用。為了進(jìn)一步探討GSPB2對(duì)2型糖尿病主動(dòng)脈損傷的保護(hù)作用及其作用靶點(diǎn)，本研究采用國(guó)際上公認(rèn)的2型糖尿病模型小鼠——db/db小鼠為研究對(duì)象，對(duì)經(jīng)GSPB2干預(yù)的db/db小鼠的主動(dòng)脈進(jìn)行iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)分析，尋找正常對(duì)照組（CC組），db/db小鼠組(DM組)與db/db小鼠GSPB2治療組（DMT組）主動(dòng)脈的差異表達(dá)蛋白，旨在揭示GSPB2對(duì)于db/db小鼠主動(dòng)脈病變的保護(hù)機(jī)制，為臨床糖尿病患者血管并發(fā)癥

7、的治療尋求更為有效的藥物提供候選靶點(diǎn)。
　　 研究目的:
　　 1.研究db/db小鼠主動(dòng)脈病變的特點(diǎn)，觀察18周齡各組小鼠主動(dòng)脈組織的病理學(xué)和超微結(jié)構(gòu)變化;
　　 2.應(yīng)用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究db/db小鼠主動(dòng)脈損傷與正常小鼠主動(dòng)脈的差異表達(dá)蛋白，明確糖尿病大血管病變的病理生理機(jī)制;
　　 3.研究db/db小鼠經(jīng)GSPB2治療后主動(dòng)脈的差異表達(dá)蛋白，篩選藥物候選靶點(diǎn)，進(jìn)一步揭示GSPB2對(duì)糖尿

8、病主動(dòng)脈的保護(hù)機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 7周齡雄性C57BLKS/J db/db小鼠16只及7周齡雄性C57BLKS/J db/m小鼠8只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)開始后，C57BLKS/J db/m小鼠8只作為正常對(duì)照組(CC)，C57BLKS/J db/db小鼠隨機(jī)分為兩組:8只DM模型組(DM)，每日予生理鹽水灌胃;8只為GSPB2干預(yù)組(DMT)，GSPB2溶于與DM組相同體積生理鹽水，以30 mg/kg/d灌

9、胃，共進(jìn)行10周。
　　 1.體重、FBG、TC、TG和AGEs的測(cè)定:實(shí)驗(yàn)期間每周定期測(cè)量體重(bodyweight，BW)并記錄。實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束，所有小鼠空腹過夜并處死，采血檢測(cè)空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)等

10、指標(biāo)。
　　 2.主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)觀察:迅速剝離主動(dòng)脈，用多聚甲醛或戊二醛固定，HE染色觀察主動(dòng)脈病理變化，測(cè)量主動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度;應(yīng)用透射電鏡觀察主動(dòng)脈組織超微結(jié)構(gòu)變化。
　　 3.蛋白質(zhì)組學(xué)（iTRAQ）分析:分別選取CC組、DM組和DMT組小鼠各4只，提取主動(dòng)脈總蛋白。各組主動(dòng)脈總蛋白采用FASP酶解得到相應(yīng)肽段。各組取60μg肽段，按照ABI公司說明書操作與標(biāo)記肽段，114標(biāo)記正常對(duì)照組，115標(biāo)記GSP

11、B2干預(yù)組，117標(biāo)記db/db糖尿病組。將各組已標(biāo)記的肽段混合后用強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱（strong cation exchange，SCX）和C18柱進(jìn)行分離，用串聯(lián)質(zhì)譜方法對(duì)在第一級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)到前體離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，產(chǎn)物離子通過第二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行分析。不同報(bào)告基團(tuán)離子強(qiáng)度的差異就代表了它所標(biāo)記的多肽的相對(duì)豐度。原始文件(raw file)用iTRAQ Result Multiple File Distiller分析定量數(shù)據(jù)，并用SEQUE

12、ST軟件鑒定多肽分子。最后，使用Identified iTRAQ Statistic Builder軟件將定量及鑒定結(jié)果進(jìn)行合并處理，得到定量和鑒定結(jié)果。采用軟件計(jì)算的ratio_biweight值作為蛋白質(zhì)定量結(jié)果，以114標(biāo)記為內(nèi)參。搜索使用的數(shù)據(jù)庫(kù)為IPI mouse(international protein index，version3.72)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)。
　　 4.蛋白質(zhì)定位分析、功能分析及相互作用網(wǎng)絡(luò)分析:采用GO

13、分類工具（http://www.geneontology.org, VERSION1.8）和KOGnitor(eukaryotic orthologousgroups)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/grace/kognitor.html）分析對(duì)經(jīng)鑒定的主動(dòng)脈蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行定位分類與功能分析。應(yīng)用Ingenuity Pathways Analysis(IPA)軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　 5

14、.蛋白質(zhì)免疫印跡方法(Western blot):部分主動(dòng)脈組織采用western blot方法檢測(cè)鑒定出的乳凝集素(milk fat globule epidermal growth factor-8，MFG-E8)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(gultathione S transferases theta-1，GSTT1)和半胱氨酸甘氨酸富集蛋白1(cysteine and glycine-rich protein1，CSRP1)的蛋白表

15、達(dá)水平以驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)的可靠性。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.一般觀察
　　 CC組小鼠生長(zhǎng)以及精神狀況良好，活躍，毛發(fā)光順。DM組小鼠實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中，逐漸表現(xiàn)為污穢無(wú)澤，被毛蓬松，少動(dòng)，明顯多飲、多食、多尿，體重快速增加。DMT組小鼠上述表現(xiàn)有所減輕。
　　 2.GSPB2對(duì)db/db小鼠體重、FBG、TC、TG和AGEs的影響
　　 實(shí)驗(yàn)前DM組與DMT組的體重差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，

16、但均顯著高于CC組(p＜0.01)。自實(shí)驗(yàn)第2周開始，DM組小鼠體重逐漸增加，一直持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束（小鼠18周齡）。DMT組小鼠與DM組相比，GSPB2能夠顯著改善DM小鼠的體重(p＜0.01)。
　　 實(shí)驗(yàn)開始時(shí)DM組與DMT組間的FBG水平無(wú)顯著性差異(p＞0.05)，但與CC組比較，兩組FBG水平均明顯升高(p＜0.01)。給予GSPB2干預(yù)10周后，DMT組小鼠的FBG水平與DM組相比輕微下降，但無(wú)顯著性差異(p＞0.05

17、)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)測(cè)量血清TC、TG和AGEs。DM組的TC、TG和AGEs與CC組相比明顯升高(p＜0.01)。GSPB2干預(yù)10周后，TC、TG和AGEs水平明顯下降(p＜0.01)。
　　 3.GSPB2對(duì)主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)的影響
　　 HE染色:光鏡下CC組主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑，內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、排列整齊，中膜主要由同心排列的彈性纖維組成，無(wú)增厚;DM組主動(dòng)脈壁層次不清，內(nèi)皮細(xì)胞損傷、突起、形態(tài)不規(guī)則，中膜明

18、顯增厚，平滑肌細(xì)胞增生。DMT組內(nèi)皮細(xì)胞損傷減輕，中膜增厚明顯減輕，平滑肌細(xì)胞和彈性纖維排列較規(guī)則。
　　 4.GSPB2對(duì)主動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)的影響
　　 電鏡下CC組主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)正常，平滑肌細(xì)胞核染色質(zhì)分布正常，可見線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體等細(xì)胞器，形態(tài)正常。DM組內(nèi)皮細(xì)胞損傷，可見插入的平滑肌細(xì)胞;彈力膜斷裂，管壁膠原纖維增多;平滑肌細(xì)胞核固縮，異染色質(zhì)增多;線粒體固縮，棒狀線粒體出現(xiàn);內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹。DMT組內(nèi)皮

19、下結(jié)構(gòu)基本正常，平滑肌細(xì)胞插入和細(xì)胞器異常明顯減輕。
　　 5.iTRAQ質(zhì)譜鑒定結(jié)果
　　 本研究經(jīng)質(zhì)譜鑒定蛋白1530個(gè)。CC組和DM組小鼠主動(dòng)脈差異表達(dá)蛋白557個(gè)（±1.5倍），其中糖尿病小鼠主動(dòng)脈組織表達(dá)上調(diào)的點(diǎn)463個(gè)，下調(diào)的點(diǎn)94個(gè)，經(jīng)GSPB2治療后回調(diào)的蛋白139個(gè)。
　　 6.GSPB2干預(yù)后差異蛋白的定位分析
　　 對(duì)質(zhì)譜鑒定得出的139個(gè)差異蛋白點(diǎn)（DM組和DMT組之間）經(jīng)過蛋白質(zhì)

20、組學(xué)工具分析，差異表達(dá)蛋白定位主要包括胞漿蛋白(40％)，胞核蛋白(18.8％)，胞膜蛋白(12.1％)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白(7.9％)，線粒體蛋白(7.3％)，分泌蛋白(6.7％)，中心體蛋白(6.0％)，核糖體蛋白(3.0％)，高爾基體蛋白(2.4％)和溶酶體蛋白(1.2％)。
　　 7.GSPB2干預(yù)后差異蛋白的功能分析
　　 對(duì)質(zhì)譜鑒定得出的139個(gè)差異蛋白點(diǎn)（DM組和DMT組之間）進(jìn)行功能分析。差異表達(dá)蛋白功能主要包括

21、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(17％)，細(xì)胞骨架蛋白(12％)，翻譯后修飾、蛋白轉(zhuǎn)換和分子伴侶蛋白(9％)，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)蛋白(7％)，細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌蛋白(6％)，細(xì)胞周期、細(xì)胞分化蛋白(4％)，核苷酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝蛋白(4％)，脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝蛋白(4％)。還有一部分蛋白分布于13個(gè)其他功能類別。
　　 8.差異表達(dá)蛋白的IPA分析
　　 應(yīng)用IPA軟件將差異表達(dá)蛋白進(jìn)行PATHWAY分析，分別繪制包括細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和脂質(zhì)代謝等通

22、路，這些通路有利于更好的理解糖尿病血管重塑的分子機(jī)制及GSPB2的干預(yù)靶點(diǎn)。
　　 9.篩選部分差異蛋白在主動(dòng)脈組織的表達(dá)改變
　　 為驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定出的部分差異蛋白在主動(dòng)脈組織的表達(dá)，應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)其中差異蛋白如MFG-E8、GSTT1和CSRP1在各組小鼠主動(dòng)脈組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組小鼠比較，MFG-E8和CSRP1在DM小鼠中表達(dá)明顯增高(p＜0.01)，應(yīng)用GSPB2治療后

23、，表達(dá)增高的蛋白有所下調(diào)(p＜0.01)。另外，GSTT1在DM小鼠中表達(dá)中與正常對(duì)照組比較表達(dá)后明顯降低(p＜0.01)，經(jīng)過GSPB2干預(yù)后該蛋白表達(dá)回調(diào)(p＜0.01)。該結(jié)果與iTRAQ鑒定結(jié)果是一致的。這些蛋白為我們將來(lái)的深入研究提供了思路。
　　 結(jié)論:
　　 1.與正常對(duì)照組比較，db/db小鼠體重顯著增加，GSPB2干預(yù)可以顯著改善db/db小鼠的肥胖趨勢(shì)。
　　 2.與正常對(duì)照組比較，db/db

24、小鼠的FBG、TC、TG和AGEs水平顯著升高，經(jīng)GSPB2治療后能夠顯著降低其TC、TG與AGEs水平。
　　 3.光鏡和電鏡顯示:db/db小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮損傷，平滑肌增殖，血管重塑，各種細(xì)胞器異常，GSPB2能夠顯著改善db/db小鼠主動(dòng)脈損傷。
　　 4.作為定量蛋白質(zhì)組學(xué)的新技術(shù)iTRAQ具有高靈敏性、高通量的特點(diǎn)，能夠?qū)Χ嘟M樣本同時(shí)進(jìn)行比較分析。因此，iTRAQ可用于研究GSPB2對(duì)db/db小鼠主動(dòng)脈保護(hù)作用

25、的分子機(jī)制，尋找新的藥物靶點(diǎn)，獲得可靠的各組差異表達(dá)蛋白。
　　 5.質(zhì)譜鑒定CC組和DM組小鼠主動(dòng)脈差異表達(dá)蛋白557個(gè)，其中DM組主動(dòng)脈組織表達(dá)上調(diào)的點(diǎn)463個(gè)，下調(diào)的點(diǎn)94個(gè)，經(jīng)GSPB2治療后回調(diào)的蛋白139個(gè)。以胞漿蛋白為主，其功能涉及細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和脂質(zhì)代謝，提示這些過程參與了T2DM主動(dòng)脈病變的發(fā)生發(fā)展。
　　 6.Western blot驗(yàn)證結(jié)果顯示，與CC組比較，MFG-E8和CSRP1在DM組小鼠

26、主動(dòng)脈中表達(dá)明顯增高，應(yīng)用GSPB2治療后，表達(dá)增高的蛋白有所下調(diào)。GSTT1在DM組小鼠中表達(dá)中與正常對(duì)照組比較表達(dá)后明顯降低，經(jīng)過GSPB2干預(yù)后該蛋白表達(dá)回調(diào)。這為深入研究GSPB2對(duì)主動(dòng)脈的保護(hù)作用提供了關(guān)鍵的候選靶點(diǎn)。
　　 第二章GSPB2對(duì)db/db小鼠主動(dòng)脈的保護(hù)機(jī)制及對(duì)MFG-E8的干預(yù)研究
　　 研究背景:
　　 隨著人類基因組計(jì)劃的完成，生命科學(xué)研究已進(jìn)入了后基因組時(shí)代。蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)

27、行者，是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究將直接闡明生命在生理或病理?xiàng)l件下的變化機(jī)制。傳統(tǒng)的對(duì)單個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行研究的方式已無(wú)法滿足后基因組時(shí)代的要求。不同生理和病理狀態(tài)下蛋白質(zhì)的表現(xiàn)是多樣的、動(dòng)態(tài)的，因此要對(duì)生命的復(fù)雜活動(dòng)有全面和深入的認(rèn)識(shí)，必然要在整體、動(dòng)態(tài)、網(wǎng)絡(luò)的水平上對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行研究。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究是其中的關(guān)鍵內(nèi)容之一。但蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)成百上千的蛋白質(zhì)的識(shí)別只是這一過程的初始階段，對(duì)大量的差異蛋白進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和篩選，進(jìn)行

28、功能驗(yàn)證以及研究其相互作用和信號(hào)通路，從而確定潛在的靶點(diǎn)才是其核心內(nèi)容。
　　 葡萄籽原花青素B2(GSPB2)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)效的自由基清除劑之一?？寡趸扒宄杂苫哪芰εc其分子結(jié)構(gòu)中含有較多的酚羥基，并與其特定分子立體化學(xué)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，GSPB2能夠抑制AGEs誘導(dǎo)的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生和血管平滑肌細(xì)胞的增殖;GSPE對(duì)1型糖尿病大鼠主動(dòng)脈具

29、有明確的保護(hù)作用。但是對(duì)2型糖尿病主動(dòng)脈的保護(hù)機(jī)制尚未深入研究，其分子靶點(diǎn)也尚未明確。傳統(tǒng)意義上的藥物研究往往注重藥物表型的觀察與單個(gè)大分子或酶解的活性，無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)于藥物作用的靶點(diǎn)的全面分析。而隨著定量蛋白質(zhì)組學(xué)與藥學(xué)研究的共同發(fā)展與結(jié)合，為藥物高效率開發(fā)與利用帶來(lái)了新的希望。本研究第一部分采用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，鑒定出CC組與DM組的差異蛋白557個(gè)，經(jīng)GSPB2治療后，此差異蛋白回調(diào)139個(gè)。我們根據(jù)已有知識(shí)、數(shù)據(jù)庫(kù)注釋和文獻(xiàn)

30、資料進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)其中MFG-E8蛋白表達(dá)DM組升高，GSPB2治療后表達(dá)降低，在DM/CC中的比值為2.41，DMT/DM的比值為0.59。
　　 MFG-E8是最早在乳脂球表面發(fā)現(xiàn)的一種親脂性糖蛋白，在很多組織細(xì)胞中均有表達(dá)。有研究表明，MFG-E8在炎癥損傷及動(dòng)脈斑塊中有表達(dá);MFG-E8隨年齡增長(zhǎng)而顯著增高;在對(duì)乳腺癌及膀胱癌等腫瘤的研究中，體內(nèi)MFG-E8的表達(dá)升高。但在糖尿病及其靶器官病變中，MFG-E8的作用尚未明

31、確。因此，本研究擬在蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究MFG-E8對(duì)糖尿病主動(dòng)脈損傷的作用，在2型糖尿病模型db/db小鼠體內(nèi)采用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)降低體內(nèi)MFG-E8蛋白的表達(dá)，以及體內(nèi)注射重組MFG-E8蛋白增加小鼠MFG-E8蛋白表達(dá)，觀察MFG-E8對(duì)T2DM主動(dòng)脈的作用，研究其內(nèi)在機(jī)制，從而為臨床早期監(jiān)測(cè)和干預(yù)，以及T2DM主動(dòng)脈并發(fā)癥的治療提供新的藥物靶點(diǎn)。
　　 研究目的:
　　 1.深入研究GSP

32、B2對(duì)db/db小鼠主動(dòng)脈的保護(hù)機(jī)制，進(jìn)一步明確糖尿病大血管病變的病理生理機(jī)制;
　　 2.構(gòu)建MFG-E8慢病毒干擾載體，以及體內(nèi)注射重組蛋白過表達(dá)MFG-E8，研究MFG-E8降低或升高對(duì)主動(dòng)脈病理學(xué)和超微結(jié)構(gòu)變化的作用，并深入研究MFG-E8參與糖尿病主動(dòng)脈損傷的作用機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 1.主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng):8周齡雄性C57BLKS/J db/m小鼠剝離主動(dòng)脈進(jìn)行主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)。將

33、主動(dòng)脈縱行剪開，平展在平皿內(nèi)，用手術(shù)刀將其切成2mm×2mm小動(dòng)脈片，然后貼入無(wú)菌的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，動(dòng)脈內(nèi)膜面與培養(yǎng)瓶玻璃面接觸，加入5 ml含20％胎牛血清的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ECM)，放于37℃5％二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7-9天細(xì)胞形成細(xì)胞單層，用0.25％的胰酶消化傳代。使用3-6代細(xì)胞用于研究。
　　 2.慢病毒干擾載體的構(gòu)建及細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染:構(gòu)建針對(duì)小鼠MFG-E8基因4個(gè)靶點(diǎn)的慢病毒干擾載體，并構(gòu)建含GFP的載體作為對(duì)照載體

34、。分別在MOI（multiplicity of infection）50、75、100的情況下進(jìn)行轉(zhuǎn)染主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，并于12h、24 h、48 h和72 h在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。確定最佳MOI值為100。轉(zhuǎn)染3天后，收集細(xì)胞使用western blot檢測(cè)MFG-E8蛋白表達(dá)下調(diào)水平，篩選出干擾效率最高的靶點(diǎn)。大規(guī)模包裝此靶點(diǎn)病毒，進(jìn)行db/db小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。
　　 3.db/db小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究MFG-E8缺失與過表達(dá)

35、對(duì)主動(dòng)脈的影響:7周齡雄性C57BLKS/J db/db小鼠32只及7周齡雄性C57BLKS/J db/m小鼠8只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)開始后，C57BLKS/J db/m小鼠8只作為正常對(duì)照組(CC)，C57BLKS/J db/db小鼠隨機(jī)分為四組:8只DM模型組(DM);8只為GFP干預(yù)組(GFP)，于小鼠14周給予GFP尾靜脈注射一次;8只為MFG-E8慢病毒干擾載體干預(yù)組(M-RNAi)，于小鼠14周給予LV-MFG-E8尾靜脈

36、注射一次;8只為重組MFG-E8蛋白干預(yù)組(rmMFG-E8)，從小鼠14周開始，每周兩次尾靜脈注射MFG-E8重組蛋白(20μg/kg)，共4周。
　　 4.MFG-E8干預(yù)對(duì)主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的影響:實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束，所有小鼠禁食12h后處死，迅速剝離主動(dòng)脈，多聚甲醛或戊二醛固定，HE染色觀察主動(dòng)脈病理變化，測(cè)量主動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度;應(yīng)用透射電鏡觀察主動(dòng)脈組織超微結(jié)構(gòu)變化。
　　 5.MFG-E8干預(yù)對(duì)主動(dòng)脈MFG-

37、E8和p-ERK蛋白表達(dá)的影響:部分主動(dòng)脈組織分離后立即投入液氮，然后-80℃保存。Western blot檢測(cè)主動(dòng)脈MFG-E8和p-ERK蛋白表達(dá)情況。
　　 6.MFG-E8干預(yù)對(duì)血清MCP-1表達(dá)的影響:采血并分離血清，檢測(cè)各組血清MCP-1表達(dá)情況。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.MFG-E8對(duì)主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)的影響
　　 HE染色:光鏡下CC組主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑，內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、排列整齊，中膜主要

38、由同心排列的彈性纖維組成，無(wú)增厚;DM組和GFP組主動(dòng)脈壁層次不清，內(nèi)皮細(xì)胞損傷、突起、形態(tài)不規(guī)則，中膜明顯增厚，平滑肌細(xì)胞增生;M-RNAi組內(nèi)皮細(xì)胞損傷減輕，中膜增厚明顯減輕，平滑肌細(xì)胞和彈性纖維排列較規(guī)則;rmMFG-E8組較DM組損傷更為明顯，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，血管壁增厚，炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，并有局部壞死。
　　 2.MFG-E8對(duì)主動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)的影響
　　 電鏡下CC組主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)正常，平滑肌

39、細(xì)胞核染色質(zhì)分布正常，可見線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體等細(xì)胞器，形態(tài)正常;DM組和GFP組內(nèi)皮細(xì)胞損傷，可見插入的平滑肌細(xì)胞;彈力膜斷裂，管壁膠原纖維增多;平滑肌細(xì)胞核固縮，異染色質(zhì)增多;線粒體固縮，棒狀線粒體出現(xiàn);內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹;M-RNAi組內(nèi)皮下結(jié)構(gòu)基本正常，平滑肌細(xì)胞插入和細(xì)胞器異常明顯減輕;rmMFG-E8組較DM組病變加重，并可見更多的異染色質(zhì)和異常細(xì)胞器，平滑肌細(xì)胞遷移入內(nèi)彈力膜。
　　 3.MFG-E8干預(yù)對(duì)主動(dòng)脈M

40、FG-E8蛋白表達(dá)的影響
　　 Western blot分析表明，與正常組小鼠相比，DM組和GFP組主動(dòng)脈組織MFG-E8的蛋白表達(dá)水平明顯升高(p＜0.01);M-RNAi干擾組MFG-E8表達(dá)較GFP組明顯降低(p＜0.01);而重組蛋白rmMFG-E8組的蛋白表達(dá)較DM組明顯升高(p＜0.01)。
　　 4.GSPB2和MFG-E8干預(yù)對(duì)主動(dòng)脈p-ERK蛋白表達(dá)的影響
　　 Western blot分析表明

41、，與正常組小鼠相比，DM組和GFP組主動(dòng)脈組織p-ERK的蛋白表達(dá)水平明顯升高(p＜0.05或p＜0.01);GSPB2治療顯著抑制p-ERK的蛋白表達(dá)水平(p＜0.01);M-RNAi干擾組p-ERK表達(dá)較GFP組明顯降低(p＜0.01);而重組蛋白rmMFG-E8組的p-ERK蛋白表達(dá)較DM組明顯升高(p＜0.01)。
　　 5.GSPB2和MFG-E8干預(yù)對(duì)血清MCP-1表達(dá)的影響
　　 ELISA法檢測(cè)血清MCP

42、-1表達(dá)情況顯示，與正常組小鼠相比，DM組和GFP組MCP-1的表達(dá)水平明顯升高(p＜0.01);GSPB2治療顯著抑制MCP-1的表達(dá)(p＜0.01);M-RNAi干擾組MCP-1表達(dá)較GFP組明顯降低(p＜0.01);而重組蛋白rmMFG-E8組的MCP-1表達(dá)較DM組明顯升高(p＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1.構(gòu)建了可靠的慢病毒MFG-E8干擾載體，并在細(xì)胞及動(dòng)物水平驗(yàn)證了其轉(zhuǎn)染效率。
　　 2.G

43、SPB2和慢病毒MFG-E8干擾載體能夠顯著抑制體內(nèi)MFG-E8蛋白表達(dá)，從而減輕2型糖尿病主動(dòng)脈的損傷;而體內(nèi)注射MFG-E8重組蛋白加重主動(dòng)脈損傷程度。
　　 3.GSPB2和慢病毒MFG-E8干擾載體能夠顯著降低主動(dòng)脈組織p-ERK蛋白表達(dá);而體內(nèi)注射MFG-E8重組蛋白增加主動(dòng)脈p-ERK蛋白表達(dá)。
　　 4.GSPB2和慢病毒MFG-E8干擾載體能夠顯著降低血清MCP-1表達(dá);而體內(nèi)注射MFG-E8重組蛋白增加