葡萄籽原花青素的降解工藝研究.pdf

1、原花青素(Proanthocyanidin，PC)是一種類黃烷醇物質(zhì)，具有超強(qiáng)抗氧化性能，已被證實(shí)有助于預(yù)防和治療由自由基引發(fā)的衰老現(xiàn)象，同時(shí)對(duì)治療心臟病和癌癥效果良好。然而，由于PC中具有大量的酚羥基，極易被氧化成花青素;同時(shí)，PC是由不同的單體聚合而成的混合物，其中含有大量的高聚體（聚合度大于4），難以透過(guò)生物膜，因此不能被人體吸收。因而獲得能被人體利用的低聚原花青素（聚合度小于4），并防止其氧化成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外降解高

2、聚原花青素的方法主要有兩類:酸解法和稀有金屬催化法。其中，前者工藝簡(jiǎn)單，但降解得率較低;后者對(duì)儀器的要求比較高，且稀有金屬屬于貴重金屬，價(jià)格昂貴，也不利于工業(yè)化生產(chǎn)。
　　基于以上研究背景，本文從原花青素的結(jié)構(gòu)和藥理性出發(fā)，對(duì)高聚原花青素降解成為可吸收的低聚原花青素的新方法進(jìn)行探討。首先，建立了原花青素的檢測(cè)方法并確立了檢測(cè)條件。在此基礎(chǔ)上，對(duì)堿降解原花青素的方法進(jìn)行探索，通過(guò)四組降解條件的優(yōu)化獲得最優(yōu)的降解條件。進(jìn)而又對(duì)生物酶解

3、法原花青素進(jìn)行探索，挑選出了N-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶，并且取得了一定的成效。
　　本文的主要研究結(jié)論如下:
　　為了測(cè)定高聚原花青素的降解效果，監(jiān)測(cè)其降解產(chǎn)物，建立并優(yōu)化了原花青素的檢測(cè)方法。首先采用香草醛-鹽酸法測(cè)定總原花青素的含量;隨后用反相高效液相色譜法初步測(cè)定單體中（+）-兒茶素和(-)-表兒茶素、二聚體中原花青素B1和B2的含量;最后用反相高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定其中單體(m/z=289)和二聚體（m/z=577

4、）的含量。通過(guò)檢測(cè)方法和條件的優(yōu)化，簡(jiǎn)化測(cè)定步驟，提高檢測(cè)精確度。
　　其次，選取氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鉀和碳酸氫鈉四種堿性不同的堿液對(duì)原花青素的降解效果進(jìn)行研究。結(jié)果表明，催化效果:氫氧化鈉＞碳酸鈉＞碳酸氫鉀或碳酸氫鈉。研究發(fā)現(xiàn)，PC降解率與溶液的堿度成正比。堿降解法最終生成1.5％的單體和2.0％的二聚體。作為一種降解原花青素的新方法，堿降解法具有降解速率快、操作步驟簡(jiǎn)單、成本低廉、易于擴(kuò)大會(huì)生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。
　　依附于生

5、物酶得率高、無(wú)污染、催化效率快等優(yōu)點(diǎn)，采用N-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶降解高聚原花青素。選取了金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的nanA基因，分別連接于高拷貝pET-duet-Ⅰ、中拷貝pMAL和啟動(dòng)子較弱的質(zhì)粒pZE載體的多克隆位點(diǎn)，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，構(gòu)建了6株重組菌，發(fā)酵并進(jìn)行SDS-PAGE驗(yàn)證，篩選得到表達(dá)金黃色葡萄球菌的nanA基因，使用高拷貝質(zhì)粒pET-duet-Ⅰ作為載體的E.coli BL21SananA-pETdue

6、t-Ⅰ效果最好。同時(shí)，發(fā)酵并純化SananA-pETduet-Ⅰ表達(dá)的N-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶，優(yōu)化降解條件表明，在50℃，pH為10時(shí)，反應(yīng)8h為該酶對(duì)高聚原花青素降解條件最優(yōu)，得到的單體為35.67mg·g-1，二聚體為14.49mg·g-1。
　　綜上所述，本文探究了堿降解法和生物酶解法對(duì)高聚原花青素的降解特性。堿降解法操作簡(jiǎn)便，價(jià)格便宜;N-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶降解法是一種全新的綠色生物酶降解法，雖然產(chǎn)量較低，但環(huán)保節(jié)能，而且