葡萄籽中原花青素的提取純化及其結(jié)構(gòu)和功能研究.pdf

1、葡萄是世界上經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的一種水果，為葡萄科(Vitaceae)葡萄屬(Vitis)植物。葡萄果實(shí)中含有大量的酚類物質(zhì)，其中30-40％存在于葡萄皮中，60-70％存在于葡萄籽中。原花青素(Proanthocyanidin，簡(jiǎn)稱PC)是葡萄籽中含量最大的酚類物質(zhì)，具有高度羥基化的結(jié)構(gòu)，能夠抗氧化、清除自由基、治療心血管疾病，有很大的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。 經(jīng)改良的香草醛-鹽酸法測(cè)定原花青素含量的精密度、準(zhǔn)確度比原方法有明顯提高，而且大大

2、提高了顯色穩(wěn)定性，縮短了分析時(shí)間。改良后的測(cè)定方法快速、簡(jiǎn)便、有效，可用于葡萄皮、籽、梗及其提取物中的游離態(tài)原花青素含量測(cè)定。在正丁醇-鹽酸液中加入SDS和2-巰基乙醇，能夠?qū)⒔Y(jié)合態(tài)中的原花青素分離出來(lái)，通過(guò)顯色反應(yīng)確定結(jié)合態(tài)原花青素的含量，其測(cè)定結(jié)果的精密度和穩(wěn)定性較好，可用于葡萄籽、梗中蛋白結(jié)合態(tài)和纖維素結(jié)合態(tài)原花青素含量的測(cè)定。葡萄籽中游離態(tài)、蛋白結(jié)合態(tài)、纖維素結(jié)合態(tài)原花青素含量分別為3.86％、2.93％、2.80％。在低溫條件

3、下貯藏，鋁箔真空包裝可減少多酚和游離態(tài)原花青素的損失以及向結(jié)合態(tài)原花青素的轉(zhuǎn)化。 以真空干燥葡萄籽為原料，用70％乙醇提取葡萄籽原花青素，其最佳工藝參數(shù)為葡萄籽粉粒度80-150目、攪拌時(shí)間55min、提取溫度15℃、加酸量0.75％。20℃時(shí)，HP-2MGL樹(shù)脂對(duì)葡萄籽原花青素的純化效果最好，吸附率為91.1％，解吸率為95.8％。經(jīng)HP-2MGL純化的GSPP3組分的原花青素含量為96.5％，明顯高于GSPP1和GSPP2。

4、LC-MS分析結(jié)果表明，GSPP3質(zhì)譜總離子流共有27個(gè)峰，說(shuō)明GSPP3組分中原花青素的組成較為復(fù)雜，其中2號(hào)峰和4號(hào)峰的質(zhì)譜及碎片信息表明，它們是原花青素二聚體。用SephadexLH-20對(duì)GSPP3組分進(jìn)一步純化，用70％丙酮洗脫得到GSPP3-SP1和GSPP3-SP2兩個(gè)組分。LC-MS分析表明，GSPP3-SP1有四個(gè)峰，GSPP3-SP2有七個(gè)峰，通過(guò)質(zhì)譜及碎片信息分析，它們主要含有單體和二聚體原花青素。 根據(jù)葡

5、萄籽原花青素提取物GSP和純化級(jí)分GSPP1、GSPP2、GSPP3紅外譜圖分析，發(fā)現(xiàn)葡萄籽原花青素基本結(jié)構(gòu)單元主要為原花青定。利用LC-MS對(duì)葡萄籽原花青素醇解產(chǎn)生的花色素進(jìn)行分析測(cè)定，確定為矢車菊素，從而證明葡萄籽原花青素主要結(jié)構(gòu)單元為花青定，即其B-環(huán)上含有兩個(gè)羥基。 激光光散射與GPC聯(lián)用測(cè)定了葡萄籽原花青素純化分級(jí)級(jí)分的重均相對(duì)分子質(zhì)量，乙酰化GSP的平均相對(duì)分子質(zhì)量為9.39×104Da，相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍較寬，多

6、分散系數(shù)為1.65；乙?；疓SPP3的重均相對(duì)分子質(zhì)量為9.64×103Da，GSPP3的重均相對(duì)分子質(zhì)量為4.26×103Da，平均聚合度為13，多分散系數(shù)為1.56，相對(duì)分子質(zhì)量分布曲線呈對(duì)稱分布，以高聚合度原花青素為主；乙酰化GSPP3-SP的重均相對(duì)分子質(zhì)量為4.25×103Da，GSPP3-SP的重均相對(duì)分子質(zhì)量為1.89×103Da，平均聚合度為6，多分散系數(shù)為1.45，分子量分布曲線基本呈對(duì)稱分布，以低聚合度原花青素為主。

7、 DPPH法測(cè)定葡萄籽原花青素抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄籽原花青素純化物抗氧化、清除自由基的能力大于Vc和蘆?。徊瓒喾优cGSPP3接近；葡萄籽原花青素提取物略低于Vc，但高于蘆丁。GSP、GSPP1、GSPP2、GSPP3、GSPP3-SP、Vc、蘆丁、茶多酚的半抑制量分別為118.01、92.59、88.20、86.07、62.80、110.24、169.88、86.56g/kg[DPPH·]，其自由基清除能力AE分別為0.85

8、×10-2、1.08×10-2、1.13×10-2、1.16×10-2、1.59×10-2、0.91×10-2、0.59×10-2、1.16×10-2。 小鼠血清生化指標(biāo)和病理切片研究表明，葡萄籽原花青素可以降低高脂模型小鼠血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的含量，對(duì)小鼠的肝脂肪變有一定的緩解和治療功能。葡萄籽原花青素對(duì)酵母菌的最小抑制濃度＞10mg/mL，對(duì)大腸桿菌的最小抑制濃度為1.25mg/mL，枯草芽孢桿菌的最小抑制濃度為

9、313μg/mL。葡萄籽原花青素對(duì)齲齒菌(即變異鏈球菌Streptococcusmutans)具有較強(qiáng)的抑制作用，100μg/mL時(shí)抑菌圈直徑為10mm，250μg/mL時(shí)為14mm，500μg/mL時(shí)為20mm。葡萄籽原花青素對(duì)沙門(mén)氏菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用，當(dāng)含菌量約為100個(gè)/mL、原花青素濃度為500μg/mL時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌率為29.6％，當(dāng)原花青素濃度為1000μg/mL時(shí)，可以完全抑制金黃色

10、葡萄球菌。而對(duì)于沙門(mén)氏菌和大腸埃希氏菌來(lái)說(shuō)，當(dāng)原花青素濃度為1000μg/mL時(shí)，抑制作用才較為顯現(xiàn)，原花青素濃度為5000μg/mL時(shí)，抑制作用顯著。 以RT-N-20乙基纖維素為壁材，以葡萄籽原花青素為心材，當(dāng)心材與壁材的比例為4:1，總固形物含量為25％，進(jìn)風(fēng)溫度為160℃時(shí)，葡萄籽原花青素微膠囊化產(chǎn)率和效率最大，分別為93.91％和95.06％。微膠囊化葡萄籽原花青素光照貯存三個(gè)月原花青素?fù)p失率比未微膠囊化減少40.01

11、％，避光貯存三個(gè)月原花青素?fù)p失率比未微膠囊化減少23.71％。以熔點(diǎn)為55℃的復(fù)合氫化植物油為壁材，以葡萄籽原花青素為心材，當(dāng)心材與壁材比為1:2時(shí)，原花青素微膠囊化產(chǎn)率和效率最高，分別為83.2％和91.5％。微膠囊化葡萄籽原花青素光照貯存三個(gè)月，原花青素?fù)p失率比未微膠囊化減少34.01％，避光貯存三個(gè)月減少27.71％。從掃描電子顯微鏡(SEM)圖片來(lái)看，微膠囊化原花青素顆粒整個(gè)表面結(jié)構(gòu)呈球狀，具有較好的連續(xù)性、完整性和致密性。以氫

12、化植物油為壁材制備的微膠囊化葡萄籽原花青素，比乙基纖維素為壁材的微膠囊產(chǎn)品表面粗糙。 當(dāng)油為外相(含量＞90％)，以油酸聚甘油單酯為表面活性劑、乙醇為助表面活性劑(4:1)，15％葡萄籽原花青素水溶液為內(nèi)相，可形成葡萄籽原花青素微乳。經(jīng)測(cè)定葡萄籽原花青素微乳液中90％微粒的平均粒徑為23.96nm。當(dāng)油與混合表面活性劑比為90:10時(shí)，葡萄籽原花青素最大添加量為1632μg/mL；當(dāng)油與混合表面活性劑比為98:2時(shí)，葡萄籽原花青