GDF11對(duì)高脂喂養(yǎng)ApoE---小鼠主動(dòng)脈的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本研究旨在明確:
　　1.GDF11對(duì)高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠血管內(nèi)皮功能障礙是否有保護(hù)作用;
　　2.GDF11對(duì)高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化是否有改善作用;
　　3.探討GDF11對(duì)高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制;
　　4.GDF11對(duì)PA誘導(dǎo)的MAECs氧化應(yīng)激及凋亡的作用;
　　5.探討GDF11對(duì)PA誘導(dǎo)的MAECs氧化應(yīng)激及凋亡的信號(hào)

2、轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　方法：
　　一、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及干預(yù):40只4周齡的SPF級(jí)雄性ApoE-/-小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字法分為陽(yáng)性對(duì)照組（Vehicle組，n=10），GDF11干預(yù)組（GDF11組，n=10），腺相關(guān)病毒-綠色熒光蛋白組(AAV-GFP組，n=10)和腺相關(guān)病毒-GDF11組（AAV-GDF11組，n=10），均以高脂喂養(yǎng)。GDF11組根據(jù)小鼠的體重每天腹腔注射含0.1mg·k

3、-1d-1的GDF11的檸檬酸鹽緩沖液0.2ml，陽(yáng)性對(duì)照組每天腹腔注射等量檸檬酸鹽緩沖液，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束;AAV-GDF11組和AAV-GFP組分別一次性尾靜脈注射0.2ml含AAV-GDF11和AAV-GFP的純化的病毒溶液。AAV-GFP組和AAV-GDF11組取小鼠的肝臟和主動(dòng)脈進(jìn)行免疫熒光染色測(cè)定其表達(dá)GDF11/8的量。
　　2.體重及血清監(jiān)測(cè):每周定期測(cè)定小鼠體重，0周時(shí)每組隨機(jī)選取三只小鼠尾靜脈取血測(cè)GDF11/8濃

4、度;GDF11干預(yù)4周和12周后，腹腔注射60 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉小鼠（4周:3只/組;12周:7只/組），皮膚消毒后開(kāi)腹，后腔靜脈采血，離心后取血清，ELISA法檢測(cè)血清GDF11/8（0周，4周和12周，其余在12周時(shí)檢測(cè)）、空腹胰島素(Fastinginsulin)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、甘油三酯(TC)、總膽固醇(TG)、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)及游離脂肪酸

5、(FFA)水平。
　　3.血管內(nèi)皮功能測(cè)定:干預(yù)4周后，每組隨機(jī)取3只小鼠進(jìn)行主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴(lài)性及非依賴(lài)性舒張功能試驗(yàn);干預(yù)12周后，免疫熒光和TUNEL雙染法測(cè)定小鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，電鏡觀(guān)察主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞情況。
　　4.主動(dòng)脈粥樣斑塊面積及相關(guān)信號(hào)分子測(cè)定:干預(yù)12周后，油紅O染色測(cè)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊表面積與動(dòng)脈壁表面積的百分比;HE染色測(cè)定主動(dòng)脈斑塊橫斷面積與主動(dòng)脈管腔面積百分比。Western blot檢測(cè)主動(dòng)脈S

6、mad2/3、磷酸化Smad2/3(P-Smad2/3)、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、P-AMPK、eNOS、P-eNOS、蛋白激酶B(Akt)、P-Akt、蛋白激酶A(PKA)、P-PKA表達(dá)水平。
　　5.主動(dòng)脈炎性浸潤(rùn)程度測(cè)定:免疫組織化學(xué)染色測(cè)定斑塊中平滑肌細(xì)胞、膠原蛋白、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度;RT-PCR測(cè)定主動(dòng)脈壁IL-6、IL-1β、TNF-α、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、干擾素-γ(IFN-γ)

7、和IL-10等炎性因子轉(zhuǎn)錄水平。
　　二、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　1.小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng):分離出的小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(MAECs)常規(guī)傳代于含20％胎牛血清、50mg/L內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、10mg/L肝素及1％青/鏈霉素的M199培養(yǎng)液接種子細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5％ CO2空氣飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2.細(xì)胞分組及檢測(cè):將MAECs分為:①Vehicle組;②PA組:0.4mmol/L PA;③PA+GDF11組:

8、0.4mmol/L PA+50ng/mL GDF11;④PA+GDF11+內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)組:0.4mmol/L PA+50ng/mL GDF11+500μmol/L L-NAME;⑤PA+GDF11+Smad3抑制劑SIS3組:0.4mmol/L PA+50ng/mLGDF11+3μmol/L SIS3，培養(yǎng)24h后，活性氧試劑盒及實(shí)時(shí)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)各組

9、細(xì)胞氧化應(yīng)激水平;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率;Western blot檢測(cè)各組Bcl-2、Bax，以及Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　一、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.AAV-GDF11注射的小鼠體內(nèi)持續(xù)表達(dá)GDF11/8
　　作為一種可以替代外源性的注射GDF11蛋白的方式，本研究采用構(gòu)建AAV-GDF11來(lái)分析體內(nèi)持續(xù)表達(dá)GDF11的效果。干預(yù)后4周，與AAV-GFP組相比，AAV-

10、GDF11組小鼠肝臟和血管表達(dá)的GDF11/8蛋白陽(yáng)性區(qū)域顯著增加，紅色熒光物質(zhì)增多;另外，我們檢測(cè)AAV-GFP組ApoE-/-小鼠血清中GDF11/8濃度，發(fā)現(xiàn)其濃度是逐漸下降的，而AAV-GDF11組小鼠血清GDF11/8濃度顯著升高，表明AAV-GDF11注射的小鼠體內(nèi)持續(xù)表達(dá)GDF11/8。
　　2.GDF11對(duì)ApoE-/-小鼠代謝及炎性因子水平的影響
　　從Vehicle組可以看出，隨著年齡的增長(zhǎng)和肥胖等因素，

11、ApoE-/-小鼠體內(nèi)的GDF11/8濃度逐漸下降，外源性的補(bǔ)充和內(nèi)源性的表達(dá)GDF11蛋白后，GDF11組小鼠血清GDF11/8濃度顯著升高。干預(yù)12周后，與Vehicle組和AAV-GFP組相比，GDF11組和AAV-GDF11組小鼠體重、空腹血糖、HbA1c無(wú)明顯差異，而血清中Fasting insulin、IL-6、TNF-α、TC、TG、ox-LDL及FFA水平明顯降低(P＜0.05)。
　　3.GDF11改善ApoE-

12、/-小鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能
　　干預(yù)4周后，測(cè)定各組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮舒張功能。與Vehicle組和AAV-GFP組相比，GDF11組和AAV-GDF11組小鼠胸主動(dòng)脈對(duì)Ach誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴(lài)性舒張反應(yīng)顯著增高(73.61±3.63％ vs.89.83±3.52％，71.32±3.89％ vs.87.17±4.13％，Ach:10-4 mmol/L，P＜0.05，圖3A);而對(duì)SNP誘導(dǎo)的內(nèi)皮非依賴(lài)性舒張功能，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

13、(P＞0.05)。
　　4.GDF11對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮凋亡及形態(tài)的影響
　　高脂喂養(yǎng)12周后，Vehicle組和AAV-GFP組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜出現(xiàn)較多凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞，電鏡下觀(guān)察到內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡和核固縮，與內(nèi)皮下組織連接不緊密，甚至脫落，而GDF11和AAV-GDF11干預(yù)顯著減少內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，細(xì)胞質(zhì)空泡及核固縮現(xiàn)象減少，內(nèi)皮細(xì)胞與周?chē)M織連接相對(duì)緊密。
　　5.GDF11顯著減少高脂喂養(yǎng)的Apo

14、E-/-小鼠主動(dòng)脈粥樣斑塊面積
　　高脂喂養(yǎng)12周使ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈粥樣斑塊表面積和橫斷面積顯著增大，而GDF11和AAV-GDF11干預(yù)顯著減小ApoE-/-糖尿病小鼠主動(dòng)脈粥樣斑塊面積(P＜0.05)。
　　二、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　與Vehicle組相比，PA組細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡率顯著增加，Bcl-2/Bax表達(dá)顯著降低，Cleaved-caspase3/β-actin表達(dá)水平顯著升高，PA+GDF11組細(xì)胞

15、氧化應(yīng)激和凋亡率、Cleaved-caspase3/β-actin表達(dá)水平明顯低于PA組，Bcl-2/Bax表達(dá)水平明顯高于PA組，而PA+GDF11+L-NAME組和PA+GDF11+SIS3組細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡率、Cleaved-caspase3/β-actin表達(dá)水平又明顯低于PA+GDF11組，Bcl-2/Bax表達(dá)水平明顯高于PA+GDF11組（P均＜0.05）。與Vehicle組相比，GDF11顯著增加P-Smad2/3表達(dá)

16、水平，而其受體抑制劑SB431542明顯降低P-Smad2/3表達(dá)水平(P＜0.05)。與Vehicle組相比，GDF11組P-AMPK/AMPK、P-eNOS/eNOS水平顯著提高(P＜0.05)，P-Akt/Akt、P-PKA/PKA水平無(wú)明顯差異(P＞0.05)，而分別加入了Compound C、L-NAME或者Compound C聯(lián)合L-NAME顯著抑制了P-AMPK/AMPK、P-eNOS/eNOS表達(dá)水平(P＜0.05)，對(duì)

17、P-Akt/Akt、P-PKA/PKA水平無(wú)明顯影響(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　GDF11可降低血中炎性因子和血脂水平，改善內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能障礙，減少血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，減小動(dòng)脈粥樣硬化斑塊表面積及橫斷面積，并可增加斑塊中平滑肌細(xì)胞及膠原蛋白含量、減少巨噬細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，調(diào)節(jié)主動(dòng)脈壁炎性因子轉(zhuǎn)錄水平，抗PA誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，上述作用機(jī)制與激活TGF-β/Smad和AMPK/eNOS