吡非尼酮經(jīng)門(mén)靜脈灌注治療大鼠肝纖維化的作用及機(jī)制研究.pdf

1、1.目的:
　　肝臟纖維化是病毒性肝炎、酒精中毒、脂肪肝等各種慢性肝損傷的最終環(huán)節(jié)，是肝硬化發(fā)生、發(fā)展的病理基礎(chǔ)。迄今為止，尚未找到一種特殊有效的治療肝纖維化的藥物。吡非尼酮是一種新的口服廣譜抗纖維化小分子藥物，其在歐洲和美國(guó)已經(jīng)被批準(zhǔn)應(yīng)用于特發(fā)性肺纖維的臨床治療中，并取得了顯著療效。由于纖維化的發(fā)生具有相似的機(jī)制，所以人們將吡非尼酮其用于其他纖維化疾病的研究并取得了不錯(cuò)的療效。而在肝纖維化治療中，吡非尼酮的療效及作用機(jī)制仍尚不明

2、確。本實(shí)驗(yàn)擬探討吡非尼酮在體外對(duì)活化的肝星形細(xì)胞的作用及吡非尼酮經(jīng)灌胃、尾靜脈注射、肝動(dòng)脈和門(mén)靜脈不同途徑給藥后，對(duì)二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型的治療作用及其機(jī)制，并篩選最佳給藥途徑，為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　2.方法:
　　2.1吡非尼酮對(duì)LX-2細(xì)胞細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、遷移和分化的影響：體外培養(yǎng)LX-2細(xì)胞株，細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后將LX-2細(xì)胞分為2組，即空白對(duì)照組和藥物處理組。吡非尼酮作用于LX-2細(xì)胞24h后，流式細(xì)

3、胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期、CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖的變化，劃痕愈合實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷徙能力的改變，免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)吡非尼酮對(duì)MCP-1蛋白表達(dá)的影響及qrt-PCR檢測(cè)吡非尼酮作用后膠原I表達(dá)的變化；
　　2.2二乙基亞硝胺誘導(dǎo)SD大鼠肝纖維化模型，造模成功后，將大鼠隨機(jī)分為6組，分別為（1）正常對(duì)照組（2）DEN模型對(duì)照組（3）吡非尼酮灌胃模型組（4）吡非尼酮經(jīng)尾靜脈給藥模型組（5）吡非尼酮經(jīng)肝動(dòng)脈給藥模型組（6）

4、吡非尼酮經(jīng)門(mén)靜脈給藥模型組。藥物處理4周后抽取大鼠血清，檢測(cè)天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)移酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)移酶(ALT)，麻醉處死各組動(dòng)物模型，HE、Masson染色觀察纖維化情況，Western Blot和qrt-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子7（Smad7）、MCP-1、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP-1）、膠原伴侶分子47（HSP47）和Collagen I表達(dá)情況。
　

5、　3.結(jié)果:
　　3.1吡非尼酮處理LX-224h后，G1期明顯縮短，與對(duì)照組相比具有差異性（p<0.05）。明顯抑制細(xì)胞增殖（p<0.05），并且這種抑制作用具有濃度依賴性（p<0.05）；在0和24小時(shí)進(jìn)行劃痕愈合測(cè)定，結(jié)果表明與對(duì)照組相比，吡非尼酮以劑量依賴的方式明顯抑制LX-2細(xì)胞的遷移能力（p<0.01）；Western Blot結(jié)果表明：吡非尼酮明顯抑制MCP-1蛋白的表達(dá)（p<0.05），并且這種抑制作用具有濃度依賴

6、性（p<0.05）； qrt-PCR結(jié)果表明：吡非尼酮明顯抑制Collagen I(實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組)的表達(dá)（p<0.01），且抑制作用具有濃度依賴性（p<0.05）。
　　3.2吡非尼酮經(jīng)不同給藥方式治療DEN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型后：與DEN模型對(duì)照組相比，PFD處理的DEN模型組中ALT、AST均明顯降低（p<0.05）；HE、Masson染色觀察：與DEN模型對(duì)照組相比，PFD可以明顯改善DEN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型的肝組織

7、的肝纖維化情況，并且經(jīng)門(mén)靜脈給藥組效果最明顯；qrt-PCR檢測(cè)結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，DEN誘導(dǎo)的模型組中TGF-β1、MCP-1、TIMP-1、MMP-2、Collagen I mRNA的表達(dá)明顯增加（p<0.01）；與DEN模型對(duì)照組相比，PFD灌胃組、PFD尾靜脈組、PFD肝動(dòng)脈組、PFD門(mén)靜脈組TGF-β1、MCP-1、TIMP-1、MMP-2、Collagen I mRNA的表達(dá)均明顯降低（p<0.05）；其中在治療組間，M

8、MP-2 mRNA的表達(dá)在PFD灌胃組降低最顯著（p<0.01），但與PFD門(mén)靜脈組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；TGF-β1、MCP-1、TIMP-1和Collagen I mRNA的表達(dá)則在PFD門(mén)靜脈組降低最明顯（p<0.01）；Western Blot檢測(cè)結(jié)果：（1）與正常對(duì)照組相比，DEN誘導(dǎo)的模型組中HSP47蛋白的表達(dá)明顯增加（p<0.01）；與DEN模型對(duì)照組相比，PFD灌胃組、PFD尾靜脈組、PFD肝動(dòng)脈組、PFD門(mén)靜脈組HSP4

9、7蛋白的表達(dá)均明顯降低（p<0.05），并且PFD肝動(dòng)脈組和PFD門(mén)靜脈組降低最明顯（p<0.05），但兩組之間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；（2）與正常對(duì)照組相比，DEN誘導(dǎo)的模型組中Smad7蛋白的表達(dá)明顯降低（p<0.01）；與DEN對(duì)照組相比，PFD灌胃組、PFD尾靜脈組、PFD肝動(dòng)脈組、PFD門(mén)靜脈組Smad7蛋白的表達(dá)均明顯增加（p<0.05），并且PFD門(mén)靜脈組Smad7蛋白表達(dá)增加最明顯（p<0.05）。
　　4.結(jié)論:

10、>　?。?）吡非尼酮處理LX-2細(xì)胞后，該藥物能明顯影響LX-2細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖和遷移能力，并通過(guò)降低細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)，減輕細(xì)胞增殖纖維化。
　?。?）經(jīng)門(mén)靜脈灌注PFD可以明顯減輕DEN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型的肝臟炎癥反應(yīng)、保護(hù)肝細(xì)胞、降低纖維化程度。并通過(guò)下調(diào)TGF-β1、MCP-1、TIMP-1、MMP-2和HSP47細(xì)胞因子的表達(dá)以及上調(diào)Smad7的表達(dá),抑制肝星形細(xì)胞的活化，阻止Collagen I的形成，延緩、逆