銀杏葉提取物治療大鼠肝纖維化的機(jī)制研究.pdf

1、肝纖維化不論何種病因，細(xì)胞外基質(zhì)(exacellularmatrix，ECM)增加是其特征，表現(xiàn)為ECM數(shù)量增加和/或成分改變。其發(fā)展的細(xì)胞和分子機(jī)制的闡明，為這一疾病的防治提供了依據(jù)。幾乎所有的臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究均提示纖維化的發(fā)生發(fā)展與氧化應(yīng)激(oxidativestress，OS)、氧自由基損傷、脂質(zhì)過氧化等有關(guān)。研究證實(shí)，抗氧化劑可通過抑制肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecell，HSC)活化和增殖，減少ECM的合成，從

2、而起到預(yù)防和減輕肝纖維化的作用。 現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉所含主要成分銀杏黃酮甙能有效地清除體內(nèi)有毒過氧自由基的作用，銀杏苦內(nèi)酯因其有高度專屬性抗血小板活化因子(PAE)的作用而引起國際醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。近年來，歐洲專題報(bào)道銀杏葉中存在活性成分Bioparyl(一種抗氧化劑)，可調(diào)節(jié)核糖核酸酶的活性，防止/逆轉(zhuǎn)各組織纖維變性，因此推測銀杏葉有抗氧化應(yīng)激作用，可促進(jìn)肝纖維化的恢復(fù)。 迄今為止對(duì)銀杏葉提取物抗肝纖維化的作用及其機(jī)制缺

3、乏系統(tǒng)深入的研究，國內(nèi)外尚無銀杏葉提取物治療實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的研究報(bào)道。為此，我們進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，利用四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，采用銀杏葉提取物對(duì)其進(jìn)行治療，觀察銀杏葉提取物對(duì)肝纖維化大鼠一般情況及肝功能指標(biāo)、肝臟組織病理學(xué)的影響；對(duì)肝組織中氧化指標(biāo)MDA的含量，SOD、GSH-PX的活性的影響；對(duì)肝纖維化大鼠細(xì)胞因子TGF-β1和ActivinA表達(dá)的影響；對(duì)肝纖維化大鼠肝星狀細(xì)胞活化及肝細(xì)胞凋亡的影響；以及對(duì)肝纖維化大鼠肝組織MMP

4、-1及TIMP-1基因表達(dá)的影響。希望通過本組實(shí)驗(yàn)研究銀杏葉提取物對(duì)大鼠肝纖維化的治療作用，并從分子水平、細(xì)胞水平以及氧化應(yīng)激、細(xì)胞外基質(zhì)降解方面探討銀杏葉提取物治療大鼠肝纖維化的作用機(jī)制，為臨床合理應(yīng)用銀杏葉制劑提供參考依據(jù)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)共分為6個(gè)部分： 1銀杏葉提取物對(duì)肝纖維化大鼠一般情況及肝功能指標(biāo)的影響目的：利用銀杏葉提取物對(duì)肝纖維化大鼠進(jìn)行治療，觀察治療過程中肝纖維化大鼠的一般情況及其血清肝功能指標(biāo)的變化。 方法：

5、48只雄性SD大鼠被隨機(jī)分為四組：正常組、肝纖維化模型組、秋水仙堿組和治療組。除正常組外，其余三組用50％的CCL4腹腔注射造模。8周后，處死正常組和模型組大鼠，分離血清行肝功能生化指標(biāo)檢測。剩余大鼠治療組每天給予銀杏葉提取物灌胃，秋水仙堿組則給予秋水仙堿灌胃治療。治療8周后，處死這兩組動(dòng)物，標(biāo)本采集和檢驗(yàn)方法同前。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，觀察各組大鼠精神、食欲、毛發(fā)等一般情況。 結(jié)果：模型組大鼠精神萎靡，活動(dòng)減少，毛色暗淡，厭食，大

6、便稀溏；治療組大鼠精神好轉(zhuǎn)，食欲提高，毛色變亮，大便逐漸成形。模型組大鼠體重較正常組明顯減輕，治療組體重增加，與模型組比較差異顯著，但與秋水仙堿組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組大鼠肝重和脾重均較正常組增加，治療組大鼠肝重和脾重則明顯減輕，與模型組和秋水仙堿組比較均有顯著性差異。血清肝功能生化指標(biāo)方面，模型組大鼠較正常組ALT、AST、AKP明顯升高，ALb明顯降低(P＜0.01)；治療組各項(xiàng)指標(biāo)較模型組明顯改善(P＜0.01)，與秋水仙堿組

7、比較差異也有顯著性意義(P＜0.01)。 結(jié)論：銀杏葉提取物能明顯改善肝纖維化大鼠精神、食欲、毛色、體重等一般情況，減輕肝纖維化大鼠肝重和脾重，顯著改善肝纖維化大鼠肝功能各項(xiàng)生化指標(biāo)。 2銀杏葉提取物對(duì)肝纖維化大鼠肝臟組織病理學(xué)影響目的：應(yīng)用銀杏葉提取物對(duì)肝纖維化大鼠進(jìn)行治療，觀察各組大鼠肝臟組織病理學(xué)變化，研究銀杏葉提取物對(duì)肝纖維化大鼠的治療作用。 方法：采用蘇木素-伊紅(HE)法對(duì)各組大鼠肝組織切片染色，光鏡

8、下觀察并進(jìn)行肝纖維化病理分級(jí)。應(yīng)用膠原纖維三色染色(Masson)法和網(wǎng)狀纖維染色法對(duì)各組大鼠肝組織切片分別進(jìn)行染色，采用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，計(jì)算出各組大鼠肝組織膠原纖維和網(wǎng)狀纖維含量并進(jìn)行對(duì)比。 結(jié)果：HE染色顯示肝纖維化分級(jí)，治療組較模型組明顯減輕(P＜0.01)，與秋水仙堿組也有顯著性差異(P＜0.05)。Masson染色顯示膠原纖維含量，模型組為11.4±1.2％，治療組為4.6±0.9％，秋水仙堿組為9.1±1

9、.0％，治療組與模型組、秋水仙堿組均有顯著性差異(P＜0.01)。網(wǎng)狀纖維染色顯示網(wǎng)狀纖維含量，模型組為12.4±0.9％，治療組為4.0±1.1％，秋水仙堿組為10.4±0.9％，治療組與模型組、秋水仙堿組差異均有顯著性意義(P＜0.01)。 結(jié)論：銀杏葉提取物能明顯減輕大鼠的肝纖維化程度，對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化有良好的治療作用。 3銀杏葉提取物對(duì)肝纖維化大鼠肝臟氧化指標(biāo)的影響目的：研究銀杏葉提取物對(duì)肝纖維化大鼠

10、肝臟氧化指標(biāo)的影響，從氧化應(yīng)激方面探討銀杏葉提取物治療大鼠肝纖維化的作用機(jī)制。 方法：應(yīng)用組織勻漿的方法對(duì)各組大鼠肝組織氧化指標(biāo)MDA、SOD及GSH-Px進(jìn)行檢測，測定其含量并進(jìn)行比較。 結(jié)果：與正常組比較，模型組SOD、GSH-Px活性明顯降低，MDA含量顯著上升；與模型組比較，秋水仙堿組SOD活性升高，GSH-Px活性、MDA含量無明顯改變；治療組SOD、GSH-Px活性顯著升高，MDA含量顯著下降，較模型組和秋水

11、仙堿組均有顯著性差異(P＜0.01)。 結(jié)論：銀杏葉提取物能顯著降低肝纖維化大鼠肝組織中MDA的含量，提高SOD、GSH-Px的活性，具有較強(qiáng)的抗氧化作用。 4銀杏葉提取物對(duì)肝纖維化大鼠TGF-β1和ActivinA表達(dá)的影響目的：研究銀杏葉提取物對(duì)肝纖維化大鼠細(xì)胞因子TGF-β1和ActivinA表達(dá)的影響，從分子水平探討銀杏葉提取物治療大鼠肝纖維化的作用機(jī)制。 方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對(duì)大鼠肝組織中TGF-

12、β1和ActivinA的蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測，采用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，計(jì)算出各組大鼠肝組織陽性染色面積百分比并進(jìn)行比較。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)對(duì)各組大鼠肝組織中TGF-β1和ActivinA的mRNA含量進(jìn)行測定，利用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)算出各自的光密度值，與內(nèi)參三磷酸甘油醛(GAPDH)的mRNA積分光密度值相比后在各組之間進(jìn)行比較。 結(jié)果：正常大鼠肝組織中幾乎不表達(dá)TGF-β1和ActivinA蛋白，模型組

13、兩者陽性染色面積百分比分別為17.1±1.0％和11.4±1.2％，治療組分別為5.6±0.7％和4.1±0.5％，秋水仙堿組分別為12.1±1.0％和9.4±0.9％，治療組與模型組、秋水仙堿組比較均有顯著性差異(P＜0.01)。RT-PCR方法顯示正常肝組織幾乎不表達(dá)TGF-β1及ActivinAmRNA，而模型組為強(qiáng)表達(dá)，治療組較模型組表達(dá)減弱，秋水仙堿組介于兩者之間，治療組與模型組、秋水仙堿組比較差異均有顯著性意義(P＜0.01

14、或P＜0.05)。 結(jié)論：銀杏葉提取物能顯著降低肝纖維化大鼠肝組織中TGF-β1和ActivinA表達(dá)，TGF-β1和ActivinA表達(dá)減少可能是銀杏葉提取物治療大鼠肝纖維化的分子機(jī)制之一。 5銀杏葉提取物對(duì)肝纖維化大鼠肝星狀細(xì)胞活化及肝細(xì)胞凋亡的影響目的：研究銀杏葉提取物對(duì)肝纖維化大鼠肝星狀細(xì)胞活化及肝細(xì)胞凋亡的影響，從細(xì)胞水平探討銀杏葉提取物治療大鼠肝纖維化的作用機(jī)制。 方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測大鼠肝

15、組織中α-SMA蛋白的表達(dá)，采用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，計(jì)算出各組大鼠肝組織陽性染色面積百分比并進(jìn)行比較。采用原位末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測大鼠肝組織中肝細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算出凋亡指數(shù)(AI)，在各組之間進(jìn)行對(duì)比。 結(jié)論：銀杏葉提取物能顯著減弱肝纖維化大鼠肝星狀細(xì)胞活化，減少肝細(xì)胞凋亡；肝星狀細(xì)胞活化減弱、細(xì)胞凋亡減少可能是銀杏葉提取物治療大鼠肝纖維化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。 6銀杏葉提取物對(duì)肝纖維化大鼠肝組織MMP-1及TI

16、MP-1基因表達(dá)的影響目的：研究銀杏葉提取物對(duì)肝纖維化大鼠肝組織MMP-1及TIMP-1基因表達(dá)的影響，進(jìn)一步從細(xì)胞外基質(zhì)降解方面探討銀杏葉提取物治療大鼠肝纖維化的作用機(jī)制。 方法：應(yīng)用采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)對(duì)各組大鼠肝組織中MMP-1及TIMP-1基因的mRNA含量進(jìn)行測定，利用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)算出各自的光密度值，與內(nèi)參三磷酸甘油醛(GAPDH)的mRNA積分光密度值相比后，在各組之間進(jìn)行比較。 結(jié)論

17、：銀杏葉提取物能明顯升高肝纖維化大鼠肝組織中MMP-1基因表達(dá)并下調(diào)TIMP-1基因表達(dá)，通過降低TIMPs表達(dá)水平，解除對(duì)MMPs的抑制，從而增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)的降解可能是銀杏葉提取物治療大鼠肝纖維化的作用機(jī)制之一。 總之，本研究表明銀杏葉提取物能明顯改善肝功能，使肝組織纖維化程度減輕，有顯著治療肝纖維化的作用。通過銀杏葉提取物治療，顯著降低了纖維化肝組織中MDA的含量，提高了SOD、GSH-Px的活性，說明銀杏葉提取物有較強(qiáng)的抗

18、氧化作用。與肝纖維化模型組相比，銀杏葉提取物治療組TGF-β1和ActivinA表達(dá)水平顯著降低，HSC活化減弱，肝細(xì)胞凋亡減少，MMP-1基因表達(dá)升高，TIMP-1基因表達(dá)下降，與SOD、GSH-Px的活性負(fù)向變化，與MDA及肝纖維化的程度同向變化。因此，通過抗氧化應(yīng)激而抑制HSC的活化，降低TGF-β1和ActivinA表達(dá)水平，減少肝細(xì)胞凋亡，下調(diào)TIMP-1基因表達(dá)并上調(diào)MMP-1基因表達(dá)可能是銀杏葉提取物治療肝纖維化的重要作用