銀杏葉提取物治療大鼠肝纖維化的機制研究.pdf

1、肝纖維化不論何種病因，細胞外基質(zhì)(exacellularmatrix，ECM)增加是其特征，表現(xiàn)為ECM數(shù)量增加和/或成分改變。其發(fā)展的細胞和分子機制的闡明，為這一疾病的防治提供了依據(jù)。幾乎所有的臨床和動物實驗研究均提示纖維化的發(fā)生發(fā)展與氧化應(yīng)激(oxidativestress，OS)、氧自由基損傷、脂質(zhì)過氧化等有關(guān)。研究證實，抗氧化劑可通過抑制肝星狀細胞(hepaticstellatecell，HSC)活化和增殖，減少ECM的合成，從

2、而起到預(yù)防和減輕肝纖維化的作用。 現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉所含主要成分銀杏黃酮甙能有效地清除體內(nèi)有毒過氧自由基的作用，銀杏苦內(nèi)酯因其有高度專屬性抗血小板活化因子(PAE)的作用而引起國際醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。近年來，歐洲專題報道銀杏葉中存在活性成分Bioparyl(一種抗氧化劑)，可調(diào)節(jié)核糖核酸酶的活性，防止/逆轉(zhuǎn)各組織纖維變性，因此推測銀杏葉有抗氧化應(yīng)激作用，可促進肝纖維化的恢復(fù)。 迄今為止對銀杏葉提取物抗肝纖維化的作用及其機制缺

3、乏系統(tǒng)深入的研究，國內(nèi)外尚無銀杏葉提取物治療實驗性肝纖維化的研究報道。為此，我們進行實驗研究，利用四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，采用銀杏葉提取物對其進行治療，觀察銀杏葉提取物對肝纖維化大鼠一般情況及肝功能指標(biāo)、肝臟組織病理學(xué)的影響；對肝組織中氧化指標(biāo)MDA的含量，SOD、GSH-PX的活性的影響；對肝纖維化大鼠細胞因子TGF-β1和ActivinA表達的影響；對肝纖維化大鼠肝星狀細胞活化及肝細胞凋亡的影響；以及對肝纖維化大鼠肝組織MMP

4、-1及TIMP-1基因表達的影響。希望通過本組實驗研究銀杏葉提取物對大鼠肝纖維化的治療作用，并從分子水平、細胞水平以及氧化應(yīng)激、細胞外基質(zhì)降解方面探討銀杏葉提取物治療大鼠肝纖維化的作用機制，為臨床合理應(yīng)用銀杏葉制劑提供參考依據(jù)。整個實驗共分為6個部分： 1銀杏葉提取物對肝纖維化大鼠一般情況及肝功能指標(biāo)的影響目的：利用銀杏葉提取物對肝纖維化大鼠進行治療，觀察治療過程中肝纖維化大鼠的一般情況及其血清肝功能指標(biāo)的變化。 方法：

5、48只雄性SD大鼠被隨機分為四組：正常組、肝纖維化模型組、秋水仙堿組和治療組。除正常組外，其余三組用50％的CCL4腹腔注射造模。8周后，處死正常組和模型組大鼠，分離血清行肝功能生化指標(biāo)檢測。剩余大鼠治療組每天給予銀杏葉提取物灌胃，秋水仙堿組則給予秋水仙堿灌胃治療。治療8周后，處死這兩組動物，標(biāo)本采集和檢驗方法同前。在整個實驗過程中，觀察各組大鼠精神、食欲、毛發(fā)等一般情況。 結(jié)果：模型組大鼠精神萎靡，活動減少，毛色暗淡，厭食，大

6、便稀溏；治療組大鼠精神好轉(zhuǎn)，食欲提高，毛色變亮，大便逐漸成形。模型組大鼠體重較正常組明顯減輕，治療組體重增加，與模型組比較差異顯著，但與秋水仙堿組比較沒有統(tǒng)計學(xué)意義。模型組大鼠肝重和脾重均較正常組增加，治療組大鼠肝重和脾重則明顯減輕，與模型組和秋水仙堿組比較均有顯著性差異。血清肝功能生化指標(biāo)方面，模型組大鼠較正常組ALT、AST、AKP明顯升高，ALb明顯降低(P＜0.01)；治療組各項指標(biāo)較模型組明顯改善(P＜0.01)，與秋水仙堿組

7、比較差異也有顯著性意義(P＜0.01)。 結(jié)論：銀杏葉提取物能明顯改善肝纖維化大鼠精神、食欲、毛色、體重等一般情況，減輕肝纖維化大鼠肝重和脾重，顯著改善肝纖維化大鼠肝功能各項生化指標(biāo)。 2銀杏葉提取物對肝纖維化大鼠肝臟組織病理學(xué)影響目的：應(yīng)用銀杏葉提取物對肝纖維化大鼠進行治療，觀察各組大鼠肝臟組織病理學(xué)變化，研究銀杏葉提取物對肝纖維化大鼠的治療作用。 方法：采用蘇木素-伊紅(HE)法對各組大鼠肝組織切片染色，光鏡

8、下觀察并進行肝纖維化病理分級。應(yīng)用膠原纖維三色染色(Masson)法和網(wǎng)狀纖維染色法對各組大鼠肝組織切片分別進行染色，采用計算機圖像分析系統(tǒng)進行分析，計算出各組大鼠肝組織膠原纖維和網(wǎng)狀纖維含量并進行對比。 結(jié)果：HE染色顯示肝纖維化分級，治療組較模型組明顯減輕(P＜0.01)，與秋水仙堿組也有顯著性差異(P＜0.05)。Masson染色顯示膠原纖維含量，模型組為11.4±1.2％，治療組為4.6±0.9％，秋水仙堿組為9.1±1

9、.0％，治療組與模型組、秋水仙堿組均有顯著性差異(P＜0.01)。網(wǎng)狀纖維染色顯示網(wǎng)狀纖維含量，模型組為12.4±0.9％，治療組為4.0±1.1％，秋水仙堿組為10.4±0.9％，治療組與模型組、秋水仙堿組差異均有顯著性意義(P＜0.01)。 結(jié)論：銀杏葉提取物能明顯減輕大鼠的肝纖維化程度，對四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化有良好的治療作用。 3銀杏葉提取物對肝纖維化大鼠肝臟氧化指標(biāo)的影響目的：研究銀杏葉提取物對肝纖維化大鼠

10、肝臟氧化指標(biāo)的影響，從氧化應(yīng)激方面探討銀杏葉提取物治療大鼠肝纖維化的作用機制。 方法：應(yīng)用組織勻漿的方法對各組大鼠肝組織氧化指標(biāo)MDA、SOD及GSH-Px進行檢測，測定其含量并進行比較。 結(jié)果：與正常組比較，模型組SOD、GSH-Px活性明顯降低，MDA含量顯著上升；與模型組比較，秋水仙堿組SOD活性升高，GSH-Px活性、MDA含量無明顯改變；治療組SOD、GSH-Px活性顯著升高，MDA含量顯著下降，較模型組和秋水

11、仙堿組均有顯著性差異(P＜0.01)。 結(jié)論：銀杏葉提取物能顯著降低肝纖維化大鼠肝組織中MDA的含量，提高SOD、GSH-Px的活性，具有較強的抗氧化作用。 4銀杏葉提取物對肝纖維化大鼠TGF-β1和ActivinA表達的影響目的：研究銀杏葉提取物對肝纖維化大鼠細胞因子TGF-β1和ActivinA表達的影響，從分子水平探討銀杏葉提取物治療大鼠肝纖維化的作用機制。 方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對大鼠肝組織中TGF-

12、β1和ActivinA的蛋白表達進行檢測，采用計算機圖像分析系統(tǒng)進行分析，計算出各組大鼠肝組織陽性染色面積百分比并進行比較。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)對各組大鼠肝組織中TGF-β1和ActivinA的mRNA含量進行測定，利用計算機圖像分析系統(tǒng)算出各自的光密度值，與內(nèi)參三磷酸甘油醛(GAPDH)的mRNA積分光密度值相比后在各組之間進行比較。 結(jié)果：正常大鼠肝組織中幾乎不表達TGF-β1和ActivinA蛋白，模型組

13、兩者陽性染色面積百分比分別為17.1±1.0％和11.4±1.2％，治療組分別為5.6±0.7％和4.1±0.5％，秋水仙堿組分別為12.1±1.0％和9.4±0.9％，治療組與模型組、秋水仙堿組比較均有顯著性差異(P＜0.01)。RT-PCR方法顯示正常肝組織幾乎不表達TGF-β1及ActivinAmRNA，而模型組為強表達，治療組較模型組表達減弱，秋水仙堿組介于兩者之間，治療組與模型組、秋水仙堿組比較差異均有顯著性意義(P＜0.01

14、或P＜0.05)。 結(jié)論：銀杏葉提取物能顯著降低肝纖維化大鼠肝組織中TGF-β1和ActivinA表達，TGF-β1和ActivinA表達減少可能是銀杏葉提取物治療大鼠肝纖維化的分子機制之一。 5銀杏葉提取物對肝纖維化大鼠肝星狀細胞活化及肝細胞凋亡的影響目的：研究銀杏葉提取物對肝纖維化大鼠肝星狀細胞活化及肝細胞凋亡的影響，從細胞水平探討銀杏葉提取物治療大鼠肝纖維化的作用機制。 方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測大鼠肝

15、組織中α-SMA蛋白的表達，采用計算機圖像分析系統(tǒng)進行分析，計算出各組大鼠肝組織陽性染色面積百分比并進行比較。采用原位末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測大鼠肝組織中肝細胞凋亡情況，計算出凋亡指數(shù)(AI)，在各組之間進行對比。 結(jié)論：銀杏葉提取物能顯著減弱肝纖維化大鼠肝星狀細胞活化，減少肝細胞凋亡；肝星狀細胞活化減弱、細胞凋亡減少可能是銀杏葉提取物治療大鼠肝纖維化的細胞學(xué)基礎(chǔ)。 6銀杏葉提取物對肝纖維化大鼠肝組織MMP-1及TI

16、MP-1基因表達的影響目的：研究銀杏葉提取物對肝纖維化大鼠肝組織MMP-1及TIMP-1基因表達的影響，進一步從細胞外基質(zhì)降解方面探討銀杏葉提取物治療大鼠肝纖維化的作用機制。 方法：應(yīng)用采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)對各組大鼠肝組織中MMP-1及TIMP-1基因的mRNA含量進行測定，利用計算機圖像分析系統(tǒng)算出各自的光密度值，與內(nèi)參三磷酸甘油醛(GAPDH)的mRNA積分光密度值相比后，在各組之間進行比較。 結(jié)論

17、：銀杏葉提取物能明顯升高肝纖維化大鼠肝組織中MMP-1基因表達并下調(diào)TIMP-1基因表達，通過降低TIMPs表達水平，解除對MMPs的抑制，從而增強細胞外基質(zhì)的降解可能是銀杏葉提取物治療大鼠肝纖維化的作用機制之一。 總之，本研究表明銀杏葉提取物能明顯改善肝功能，使肝組織纖維化程度減輕，有顯著治療肝纖維化的作用。通過銀杏葉提取物治療，顯著降低了纖維化肝組織中MDA的含量，提高了SOD、GSH-Px的活性，說明銀杏葉提取物有較強的抗

18、氧化作用。與肝纖維化模型組相比，銀杏葉提取物治療組TGF-β1和ActivinA表達水平顯著降低，HSC活化減弱，肝細胞凋亡減少，MMP-1基因表達升高，TIMP-1基因表達下降，與SOD、GSH-Px的活性負向變化，與MDA及肝纖維化的程度同向變化。因此，通過抗氧化應(yīng)激而抑制HSC的活化，降低TGF-β1和ActivinA表達水平，減少肝細胞凋亡，下調(diào)TIMP-1基因表達并上調(diào)MMP-1基因表達可能是銀杏葉提取物治療肝纖維化的重要作用