銀杏葉提取物對(duì)大鼠膠質(zhì)瘤作用機(jī)制的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：腦惡性膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的44.6％。雖然手術(shù)治療是目前臨床的首選方法，但膠質(zhì)瘤是以浸潤(rùn)性、擴(kuò)展性生長(zhǎng)為特征，與正常腦組織間常無(wú)明顯邊界，多侵犯一個(gè)以上腦葉，故手術(shù)難以根除，且膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)射線(xiàn)不敏感，化療藥物又難以透過(guò)血腦屏障，目前尚缺乏滿(mǎn)意的治療手段，因而具有很高的復(fù)發(fā)率，死亡率高，治療效果差，手術(shù)治療聯(lián)合化療、放療后患者的平均生存期仍然不到一年。臨床上手術(shù)、放療、化療等治療方法及術(shù)后的預(yù)防都是與藥物治

2、療分不開(kāi)的，所以研究一種高效低毒的藥物來(lái)治療腦膠質(zhì)瘤成為神經(jīng)外科最受關(guān)注的研究課題。從銀杏葉中提取的藥用有效成分已經(jīng)基本明確，主要是黃酮苷和包括銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯在內(nèi)的特有的萜烯，簡(jiǎn)稱(chēng)銀杏葉提取物（Ginkgo biloba Extract，GbE）。法、德等國(guó)家從20世紀(jì)70年代開(kāi)始利用GbE制成藥品，取得了很好的治療效果。我國(guó)也相繼進(jìn)行了銀杏葉提取物的研究開(kāi)發(fā)，杏花雨注射液是新研制的銀杏葉提取物注射液，其黃酮苷含量為49.79％，萜

3、烯類(lèi)為4.4％。本課題采用銀杏葉提取物注射液對(duì)大鼠腦膠質(zhì)瘤模型進(jìn)行干預(yù)，探討其抗腫瘤的作用機(jī)制，從而為銀杏葉提取物在臨床治療方面提供有利的理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)：體外培養(yǎng)大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，對(duì)大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株進(jìn)行復(fù)蘇，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中37℃進(jìn)行培養(yǎng)后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，消化、吹打均勻于顯微鏡下計(jì)數(shù)，并制成細(xì)胞懸液。接種前采用臺(tái)盼藍(lán)據(jù)染法測(cè)定細(xì)胞存活率達(dá)

4、95％以上。
　　 2、SD大鼠腦膠質(zhì)瘤模型建立：微量注射器抽取10μl細(xì)胞懸液，含有約1.0×106 C6細(xì)胞，接種部位為大鼠右側(cè)尾狀核。接種后10天，行強(qiáng)化頭部M砌檢查，確定目標(biāo)部位有腫瘤形成，模型制作成功。
　　 3、將模型鼠（荷瘤鼠）隨機(jī)分為三組，每組分別給予相應(yīng)治療措施。對(duì)照組：腹腔內(nèi)注射二甲基亞砜（DMSO）0.2ml，生理鹽水1ml，每日一次，共七次；銀杏葉提取物組：每天腹腔內(nèi)注射杏花雨注射液35mg/kg

5、（依據(jù)文獻(xiàn)經(jīng)驗(yàn)選擇）。生理鹽水1ml，每日一次，共七次；順鉑組：腹腔內(nèi)注射DMSO0.2ml，順鉑1.mg/kg（溶于1ml生理鹽水），每日一次，共七次。
　　 4、藥物干預(yù)前后分別行MRI及增強(qiáng)掃描檢查，直觀(guān)觀(guān)察腫瘤的生長(zhǎng)情況（形態(tài)及大小改變）；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）標(biāo)記指數(shù)；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）水平的表達(dá)。探討銀杏葉提取物體內(nèi)培養(yǎng)的SD大鼠C6膠質(zhì)瘤腫瘤細(xì)胞增殖的

6、影響。
　　 5、數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用spss11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05為差異有顯著性意義；P<0.01為差異有高度顯著性意義。
　　 結(jié)果：膠質(zhì)瘤模型建立成功，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組大鼠證實(shí)顱內(nèi)均有腫瘤生長(zhǎng)。治療組大鼠均較對(duì)照組大鼠生存狀態(tài)為佳，生存期延長(zhǎng)，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組平均生存期分別為20天、23天與28天。銀杏提取物治療效果明顯，對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。順鉑組

7、與銀杏提取物均有一定地抑瘤作用，以后者的抑瘤作用較強(qiáng)，腫瘤體積較對(duì)照組明顯縮小。MRJ增強(qiáng)掃描能較好的反應(yīng)顱內(nèi)C6膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)情況。MRI影像掃描顯示：腫瘤均勻強(qiáng)化，邊界清楚，同側(cè)腦室受壓，中線(xiàn)結(jié)構(gòu)移位明顯。腫瘤大體組織標(biāo)本觀(guān)察，腫瘤占據(jù)右側(cè)大腦半球大部，向周?chē)?rùn)生長(zhǎng)，可見(jiàn)大片壞死液化組織。治療后各組與對(duì)照組影像對(duì)比，腫瘤體積增大不明顯，明顯受抑制。對(duì)照組腫瘤體積為97.8±3.6mm3，腫瘤體積較大，而治療組大鼠經(jīng)過(guò)干預(yù)因素作用之后，

8、瘤體的生長(zhǎng)受到不同程度的抑制，順鉑組和銀杏提取物組的腫瘤體積分別為62.3±7.6mm3，55.1±3.8mm3，各組與對(duì)照組比較均有顯著性差異，P<0.01。治療組腫瘤體積與對(duì)照組腫瘤體積相比有不同程度的縮小，說(shuō)明藥物均對(duì)腫瘤有抑制作用。順鉑組和銀杏提取物的抑瘤率分別為36.2％和43.7％，抑瘤率均>30％，顯示腫瘤對(duì)此兩種治療方案均敏感，治療有效果。光鏡下觀(guān)察，對(duì)照組的瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活躍密集成群，瘤細(xì)胞異型性明顯，體積大，胞質(zhì)紅染，細(xì)

9、胞核大深染，核分裂像多見(jiàn)，少數(shù)細(xì)胞可見(jiàn)核固縮、濃染。治療后可見(jiàn)瘤細(xì)胞數(shù)量明顯減少，腫瘤細(xì)胞壞死，可見(jiàn)大量的凋亡細(xì)胞，核分裂象較少見(jiàn)，亦可見(jiàn)壞死的細(xì)胞及出血灶。免疫組化結(jié)果分析，PCNA陽(yáng)性細(xì)胞的胞核呈黃色或棕黃色。對(duì)照組腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞密度高，治療組可見(jiàn)腫瘤內(nèi)PCNA陽(yáng)性細(xì)胞密度下降，核PCNA陽(yáng)性強(qiáng)度減弱，隨濃度增加陽(yáng)性率呈下降趨勢(shì)，治療組核PCNA陽(yáng)性細(xì)胞密度顯著低于對(duì)照組。（P<0.01）VEGF陽(yáng)性細(xì)胞染色定位于胞漿內(nèi)，對(duì)照組胞

10、漿內(nèi)含棕黃色顆粒密集，呈陽(yáng)性表達(dá)，治療組可見(jiàn)腫瘤內(nèi)胞漿內(nèi)著色淺，反應(yīng)顆粒減少，陽(yáng)性率表達(dá)程度降低，與對(duì)照組有顯著性差異（P<0.01）
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)證實(shí)銀杏提取物能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，明顯延長(zhǎng)生存期；應(yīng)用MRI、光鏡以及免疫組化法檢測(cè)PCNA表達(dá)和VEGF表達(dá)，顯示經(jīng)銀杏提取物治療后可見(jiàn)腫瘤體積縮小、腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生、PCNA和VEGF陽(yáng)性細(xì)胞密度下降，核陽(yáng)性強(qiáng)度減弱。以上研究結(jié)果證實(shí)了銀杏提取物能夠抑制大鼠顱內(nèi)C6膠質(zhì)瘤細(xì)