銀杏葉提取物對大鼠膠質(zhì)瘤作用機制的體內(nèi)實驗研究.pdf

1、目的：腦惡性膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的44.6％。雖然手術(shù)治療是目前臨床的首選方法，但膠質(zhì)瘤是以浸潤性、擴展性生長為特征，與正常腦組織間常無明顯邊界，多侵犯一個以上腦葉，故手術(shù)難以根除，且膠質(zhì)瘤細胞對射線不敏感，化療藥物又難以透過血腦屏障，目前尚缺乏滿意的治療手段，因而具有很高的復發(fā)率，死亡率高，治療效果差，手術(shù)治療聯(lián)合化療、放療后患者的平均生存期仍然不到一年。臨床上手術(shù)、放療、化療等治療方法及術(shù)后的預防都是與藥物治

2、療分不開的，所以研究一種高效低毒的藥物來治療腦膠質(zhì)瘤成為神經(jīng)外科最受關(guān)注的研究課題。從銀杏葉中提取的藥用有效成分已經(jīng)基本明確，主要是黃酮苷和包括銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯在內(nèi)的特有的萜烯，簡稱銀杏葉提取物（Ginkgo biloba Extract，GbE）。法、德等國家從20世紀70年代開始利用GbE制成藥品，取得了很好的治療效果。我國也相繼進行了銀杏葉提取物的研究開發(fā)，杏花雨注射液是新研制的銀杏葉提取物注射液，其黃酮苷含量為49.79％，萜

3、烯類為4.4％。本課題采用銀杏葉提取物注射液對大鼠腦膠質(zhì)瘤模型進行干預，探討其抗腫瘤的作用機制，從而為銀杏葉提取物在臨床治療方面提供有利的理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、細胞培養(yǎng)：體外培養(yǎng)大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞，對大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞株進行復蘇，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中37℃進行培養(yǎng)后，取對數(shù)生長期的C6膠質(zhì)瘤細胞，消化、吹打均勻于顯微鏡下計數(shù)，并制成細胞懸液。接種前采用臺盼藍據(jù)染法測定細胞存活率達

4、95％以上。
　　 2、SD大鼠腦膠質(zhì)瘤模型建立：微量注射器抽取10μl細胞懸液，含有約1.0×106 C6細胞，接種部位為大鼠右側(cè)尾狀核。接種后10天，行強化頭部M砌檢查，確定目標部位有腫瘤形成，模型制作成功。
　　 3、將模型鼠（荷瘤鼠）隨機分為三組，每組分別給予相應治療措施。對照組：腹腔內(nèi)注射二甲基亞砜（DMSO）0.2ml，生理鹽水1ml，每日一次，共七次；銀杏葉提取物組：每天腹腔內(nèi)注射杏花雨注射液35mg/kg

5、（依據(jù)文獻經(jīng)驗選擇）。生理鹽水1ml，每日一次，共七次；順鉑組：腹腔內(nèi)注射DMSO0.2ml，順鉑1.mg/kg（溶于1ml生理鹽水），每日一次，共七次。
　　 4、藥物干預前后分別行MRI及增強掃描檢查，直觀觀察腫瘤的生長情況（形態(tài)及大小改變）；免疫組織化學法檢測增殖細胞核抗原（PCNA）標記指數(shù)；免疫組織化學法檢測腦膠質(zhì)瘤組織中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）水平的表達。探討銀杏葉提取物體內(nèi)培養(yǎng)的SD大鼠C6膠質(zhì)瘤腫瘤細胞增殖的

6、影響。
　　 5、數(shù)據(jù)以均數(shù)士標準差表示，統(tǒng)計學處理采用spss11.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，t檢驗進行分析。P<0.05為差異有顯著性意義；P<0.01為差異有高度顯著性意義。
　　 結(jié)果：膠質(zhì)瘤模型建立成功，三個實驗組大鼠證實顱內(nèi)均有腫瘤生長。治療組大鼠均較對照組大鼠生存狀態(tài)為佳，生存期延長，三個實驗組平均生存期分別為20天、23天與28天。銀杏提取物治療效果明顯，對C6膠質(zhì)瘤細胞生長具有明顯的抑制作用。順鉑組

7、與銀杏提取物均有一定地抑瘤作用，以后者的抑瘤作用較強，腫瘤體積較對照組明顯縮小。MRJ增強掃描能較好的反應顱內(nèi)C6膠質(zhì)瘤生長情況。MRI影像掃描顯示：腫瘤均勻強化，邊界清楚，同側(cè)腦室受壓，中線結(jié)構(gòu)移位明顯。腫瘤大體組織標本觀察，腫瘤占據(jù)右側(cè)大腦半球大部，向周圍浸潤生長，可見大片壞死液化組織。治療后各組與對照組影像對比，腫瘤體積增大不明顯，明顯受抑制。對照組腫瘤體積為97.8±3.6mm3，腫瘤體積較大，而治療組大鼠經(jīng)過干預因素作用之后，

8、瘤體的生長受到不同程度的抑制，順鉑組和銀杏提取物組的腫瘤體積分別為62.3±7.6mm3，55.1±3.8mm3，各組與對照組比較均有顯著性差異，P<0.01。治療組腫瘤體積與對照組腫瘤體積相比有不同程度的縮小，說明藥物均對腫瘤有抑制作用。順鉑組和銀杏提取物的抑瘤率分別為36.2％和43.7％，抑瘤率均>30％，顯示腫瘤對此兩種治療方案均敏感，治療有效果。光鏡下觀察，對照組的瘤細胞生長活躍密集成群，瘤細胞異型性明顯，體積大，胞質(zhì)紅染，細

9、胞核大深染，核分裂像多見，少數(shù)細胞可見核固縮、濃染。治療后可見瘤細胞數(shù)量明顯減少，腫瘤細胞壞死，可見大量的凋亡細胞，核分裂象較少見，亦可見壞死的細胞及出血灶。免疫組化結(jié)果分析，PCNA陽性細胞的胞核呈黃色或棕黃色。對照組腫瘤細胞陽性細胞密度高，治療組可見腫瘤內(nèi)PCNA陽性細胞密度下降，核PCNA陽性強度減弱，隨濃度增加陽性率呈下降趨勢，治療組核PCNA陽性細胞密度顯著低于對照組。（P<0.01）VEGF陽性細胞染色定位于胞漿內(nèi)，對照組胞

10、漿內(nèi)含棕黃色顆粒密集，呈陽性表達，治療組可見腫瘤內(nèi)胞漿內(nèi)著色淺，反應顆粒減少，陽性率表達程度降低，與對照組有顯著性差異（P<0.01）
　　 結(jié)論：本實驗證實銀杏提取物能顯著抑制腫瘤生長，明顯延長生存期；應用MRI、光鏡以及免疫組化法檢測PCNA表達和VEGF表達，顯示經(jīng)銀杏提取物治療后可見腫瘤體積縮小、腫瘤細胞凋亡發(fā)生、PCNA和VEGF陽性細胞密度下降，核陽性強度減弱。以上研究結(jié)果證實了銀杏提取物能夠抑制大鼠顱內(nèi)C6膠質(zhì)瘤細