銀杏葉提取物對(duì)辛伐他汀藥物代謝影響的研究.pdf

1、研究背景
　　 多藥聯(lián)合已經(jīng)成為臨床治療的必要手段,我們?cè)谑斋@療效的同時(shí),也感慨由于藥物相互作用所導(dǎo)致的負(fù)面效應(yīng),因此研究藥物的相互作用以保證臨床用藥的安全合理,具有十分重要的現(xiàn)實(shí)價(jià)值。目前關(guān)于西藥之間相互作用的研究已經(jīng)屢見(jiàn)不鮮,但是對(duì)于中西藥之間的相互作用,人們的關(guān)注和認(rèn)識(shí)顯然還不夠,而鑒于臨床中西藥聯(lián)用越來(lái)越普遍的現(xiàn)象,研究中西藥合用時(shí)的藥物相互作用,以保證用藥的安全合理,已經(jīng)刻不容緩。
　　 銀杏葉提取物作為最常用

2、的一類中藥具有多重藥理作用,包括降血脂、改善內(nèi)皮細(xì)胞功能、降低血液粘稠度、清除自由基和抗動(dòng)脈粥樣硬化等,在臨床常能見(jiàn)到同其它藥物聯(lián)合使用,辛伐他汀便是其中之一。辛伐他汀作為他汀類藥物的代表,不僅是降低LDL的一線藥物,還可以穩(wěn)定動(dòng)脈斑塊,明顯減少致死性和非致死性心血管事件的發(fā)生率,其不良反應(yīng)一般表現(xiàn)為皮疹、頭痛和胃腸不適,嚴(yán)重者可以出現(xiàn)肝損傷和橫紋肌溶解,威脅生命,然而無(wú)論是辛伐他汀的療效還是不良反應(yīng)的發(fā)生都與其血藥濃度之間存在著明顯的

3、正相關(guān)。
　　 研究目的
　　 本實(shí)驗(yàn)課題是針對(duì)銀杏葉提取物同辛伐他汀之間的相互作用進(jìn)行研究,以揭示銀杏葉提取物對(duì)辛伐他汀代謝及其代謝關(guān)鍵酶CYP3A的影響,除了可以為兩藥在臨床的合理聯(lián)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù),好可以進(jìn)一步提示銀杏葉提取物同其他CYP3A底物藥物的相互作用。
　　 研究方法
　　 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組
　　 雌性SD大鼠32只,體重200±20 g。將32只大鼠隨機(jī)分為4組,每組8只,分

4、別為:生理鹽水對(duì)照組(10 ml·kg-1)； PB誘導(dǎo)組(80 mg·kg-1)[1]；銀杏葉提取物低劑量組(20 mg·kg-1)；銀杏葉提取物高劑量組(200 mg·kg-1)。均為灌胃給藥,一天1次,連續(xù)10天。
　　 2肝微粒體制備
　　 于末次給藥后將大鼠全部斷頸處死,灌注后摘取肝臟,濾紙吸干并稱重,按照1/4(w/v)加入磷酸鹽緩沖液Ⅰ制備成肝勻漿,離心取上清液于105000 g再經(jīng)兩次離心后即得肝微粒體沉

5、淀。將微粒體沉淀重懸于磷酸鹽緩沖液Ⅱ中,分裝并置于-80℃保存待用。
　　 3觀察指標(biāo)
　　 3.1肝微粒體蛋白含量測(cè)定
　　 用BCA試劑盒進(jìn)行肝微粒體蛋白定量分析。
　　 3.1.1牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
　　 選擇波長(zhǎng)545nm,上紫外分光光度機(jī)測(cè)A值,均做復(fù)管測(cè)定后取均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　 3.1.2樣品微粒體蛋白含量測(cè)定
　　 根據(jù)BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)讀取蛋白濃

6、度。
　　 3.2紅霉素N-脫甲基酶(ERDase)活性測(cè)定
　　 ERDase可以反映CYP3A的活性。測(cè)定方法參考了徐淑云的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》。
　　 3.3辛伐他汀體外代謝測(cè)定
　　 用HPLC法測(cè)定各組體外反應(yīng)體系中剩余辛伐他汀的含量。
　　 3.3.1體外反應(yīng)體系
　　 0.5 mL的肝微粒體反應(yīng)體系中含10 mmol·L-1MgCl2、2.5 mmol·L-1NADP、25mm

7、ol·L-1Na2G-6-P和1 U·mL-1G-6-PDH。
　　 3.3.2樣品處理及色譜條件
　　 包括檢測(cè)方法的精密度、回收率及穩(wěn)定性。
　　 3.3.3配制辛伐他汀系列標(biāo)準(zhǔn)濃度
　　 3.3.4辛伐他汀體外代謝測(cè)定
　　 4數(shù)據(jù)處理
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS(10.0版,2000SPSSInc)進(jìn)行分析,所得數(shù)據(jù)均用(X)±S表示雙尾F檢驗(yàn)來(lái)分析各組各指標(biāo)間的差異。

8、r>　　 研究結(jié)果
　　 1肝微粒體蛋白含量
　　 1.1 BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線
　　 曲線方程為:y=0.0005x+0.1303(R2=0.9462)。
　　 1.2樣品微粒體蛋白測(cè)定結(jié)果
　　 結(jié)果顯示與生理鹽水對(duì)照組比較,低劑量銀杏葉組微粒體蛋白含量沒(méi)有明顯變化；高劑量組微粒體蛋白增加,為對(duì)照組的1.14倍(P<0.05)；陽(yáng)性對(duì)照組蛋白含量顯著增加,約為生理鹽水對(duì)照組的1.7倍(P<0.05

9、)。結(jié)果見(jiàn)表1。
　　 表1各組肝微粒體蛋白含量的比較((x)±s,n=7)
　　 注:與生理鹽水對(duì)照組比較*p<0.05,**p<0.01。
　　 2紅霉素N-脫甲基酶(ERDase)活性測(cè)定結(jié)果
　　 與生理鹽水對(duì)照組比較,低劑量銀杏葉組ERDase活性略有增加,但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；高劑量組ERDase活性顯著增加,約為對(duì)照組的1.8倍(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。
　　 表2各

10、組ERDase活性的比較((x)s,n=7)
　　 注:與生理鹽水對(duì)照組比較術(shù)p<0.05,**p<0.01。
　　 3辛伐他汀體外代謝測(cè)定
　　 3.1色譜情況
　　 辛伐他汀保留時(shí)間為2.5min,與反應(yīng)體系中其他雜質(zhì)基線分離良好。
　　 3.2辛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)曲線
　　 曲線方程為:y=4096.7x-110.22(R2=0.9995),結(jié)果表明辛伐他汀濃度在1～10μg·mL-1的范圍

11、內(nèi)線性關(guān)系良好,該法將辛伐他汀的最低檢測(cè)限定義在1μg·mL-1。
　　 3.3精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 結(jié)果顯示10μg·mL-1；6μg·mL-1；1μg·mL-1的日內(nèi)、日間的RSD分別為:1.44％、1.72％；1.57％、1.83％:2.2％、2.81％。
　　 3.4回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 辛伐他汀濃度在1 ug·mL-1；6 ug·mL-1；10 ug·ML-1的相對(duì)回收率及相應(yīng)RSD分別為:10

12、3.33％、2.2％；99.37％、1.58％:99.53％、1.44％。
　　 辛伐他汀濃度在1 ug·ML-1；6 ug·mL-1；10 ug·mL-1的絕對(duì)回收率及相應(yīng)RSD分別為:96.27％、2.26％；97.18％、1.58％:97.12％、1.44％。
　　 3.5穩(wěn)定性試驗(yàn)
　　 分別于1、3、7、10、14d進(jìn)樣測(cè)定,辛伐他汀濃度在1、6、10μg·mL-1的RSD分別為2.10％、1.06％、

13、1.83％。
　　 3.6辛伐他汀體外反應(yīng)結(jié)果
　　 結(jié)果顯示與生理鹽水對(duì)照組比較,PB組和高劑量銀杏葉組辛伐他汀體外代謝均顯著加快,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而低劑量銀杏葉組與生理鹽水組比較,辛伐他汀體外代謝并沒(méi)有明顯改變(P>0.05),結(jié)果見(jiàn)表3。
　　 表3各組辛伐他汀體外代謝情況比較((x)±s,n=6)
　　 注:與生理鹽水對(duì)照組比較*p<0.05,**p<0.01。
　　

14、討論
　　 1細(xì)胞色素P450與藥物相互作用
　　 細(xì)胞色素P450縮寫CYP450,是一種單加氧酶,由于還原性的P450與一氧化碳的復(fù)合物在波長(zhǎng)450nm處有最大的吸收峰而得名。CYP450參與了絕大多數(shù)藥物的代謝,是藥物代謝過(guò)程中的主要限速酶,在藥物的相互作用中扮演了重要角色。藥物在體內(nèi)的代謝主要經(jīng)歷兩步反應(yīng),第一步為Ⅰ相反應(yīng),其間藥物被氧化、還原或水解為極性更大的代謝物,催化Ⅰ相反應(yīng)的關(guān)鍵酶即為CYP450。在CY

15、P450的大家族中與藥物代謝有關(guān)的酶主要為CYP1、CYP2、CYP3家族中7種重要的亞型:CYP1A2(占CYP450代謝總藥物的4％)、CYP2A6(2％),、CYP2C9(10％)、CYP2C19(2％)、CYP2D6(30％)、CYP2E1(2％)、CYP3A4(50％)。
　　 2銀杏葉提取物與細(xì)胞色素P450
　　 銀杏葉提取物的主要活性成分有兩大類,分別為黃酮類和萜內(nèi)酯類。其中黃酮約占24％,主要包括槲皮素

16、、山萘酚、異鼠李素及其甙類化合物；萜內(nèi)酯類約占6％,以銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯為主。有研究表明槲皮素和山萘酚可以明顯抑制CYP3A的活性,并推測(cè)其作用環(huán)節(jié)可能發(fā)生在表達(dá)后水平。另外有人在研究中發(fā)現(xiàn),銀杏葉的另一類主要成分三萜內(nèi)酯類化合物,銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯對(duì)CYP3A也呈現(xiàn)一定的抑制作用,照此來(lái)推測(cè),我們較容易認(rèn)為銀杏葉提取物整體應(yīng)該抑制CYP3A的活性,但是國(guó)外的一項(xiàng)研究卻得出了完全不同的結(jié)論。
　　 3銀杏葉提取物與辛伐他汀

17、>　　 在本實(shí)驗(yàn)條件下,低劑量銀杏葉制劑與辛伐他汀合用時(shí),并沒(méi)有顯著的相互作用發(fā)生,提示兩藥在常規(guī)劑量下的合用是基本安全的；而在高劑量銀杏葉組(相當(dāng)于臨床常用劑量的10倍),銀杏葉提取物則可以明顯促進(jìn)辛伐他汀的體外代謝,酶學(xué)研究也表明,高劑量銀杏葉制劑可以誘導(dǎo)大鼠體內(nèi)CYP3A的活性。綜合以上結(jié)果,可以推斷當(dāng)高劑量銀杏葉制劑與辛伐他汀合用時(shí)很可能會(huì)降低辛伐他汀的血藥濃度,從而降低其不良反應(yīng)的發(fā)生,但同時(shí)也可能降低辛伐他汀的療效。

18、>　　 結(jié)論
　　 在本實(shí)驗(yàn)條件下,大劑量的銀杏葉提取物(相當(dāng)于臨床常用劑量的10倍)對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠肝微粒體CYP3A的活性表現(xiàn)出了一定的誘導(dǎo)作用,此作用雖弱于苯巴比妥鈉陽(yáng)性組,但足以引起同CYP3A底物藥物相互作用的發(fā)生,辛伐他汀的體外代謝實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了這一點(diǎn),因此推斷當(dāng)辛伐他汀與大劑量銀杏葉提取物制劑合用時(shí),可能會(huì)通過(guò)藥物的相互作用而影響到辛伐他汀的療效。而低劑量的銀杏葉提取物(相當(dāng)于臨床常用劑量)由于對(duì)CYP3A活性及辛伐