銀杏葉提取物抗四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　肝纖維化是機(jī)體對(duì)各種慢性肝損傷所進(jìn)行的修復(fù)反應(yīng)，具有可逆性。若慢性肝損傷持續(xù)存在和發(fā)展，肝纖維化則可惡化為不可逆的肝硬化。銀杏葉提取物（GBE）是從干燥的銀杏葉中提取出來的物質(zhì)，具有抗氧化、清除自由基和抗血小板凝聚等多種藥理學(xué)作用。近幾年來，有研究發(fā)現(xiàn)GBE在抗肝纖維化方面也具有很好的活性。本課題將通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確GBE對(duì)大鼠肝纖維化的抑制作用并探討其發(fā)揮抗肝纖維化作用的分子機(jī)制。
　　方法：
　　將

2、48只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（對(duì)照組）、灌胃建模組（模型組）、GBE高劑量給藥組（高劑量組）和GBE低劑量給藥組（低劑量組），每組12只。除了對(duì)照組外，其余各組大鼠通過每周兩次50%CCl4/花生油溶液（1mL·kg-1）灌胃，誘導(dǎo)建立肝纖維化模型。在建模的同時(shí)，高劑量組按體質(zhì)量每天一次腹腔注射GBE30mg·kg-1，低劑量組按體質(zhì)量每天一次腹腔注射GBE15 mg·kg-1。8周后，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠肝功能指標(biāo)

3、總膽紅素（TBIL）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）及丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)肝纖維化指標(biāo)透明質(zhì)酸（HA）、IV型膠原蛋白（IV-C）、層黏連蛋白（LN）及III型前膠原肽（PIIINP）。同時(shí)觀察大鼠肝臟形態(tài)，采集肝組織樣品。HE染色和Masson染色對(duì)肝組織作病理學(xué)檢查；Western blot實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)肝組織中核蛋白（NF-κB）、質(zhì)蛋白（NF-κB和 IκBα）以及總蛋白（p38MAPK、p-p38MAPK、Bcl-2

4、、Bax和 Caspase-3）的表達(dá)水平；免疫組化平行實(shí)驗(yàn)考察 GBE對(duì)大鼠肝組織中p38MAPK、NF-κB、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響；半定量RT-PCR和Real-time PCR檢測(cè)HSCs激活因子（Colla1、Colla2、MMP-1、TIMP-1、α-SMA和Desmin）和炎癥相關(guān)因子（Cox-2、IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β），考察GBE對(duì)HSCs和炎癥的影響。
　　結(jié)果:
　　1.

5、50%CCl4/花生油溶液（1mL·kg-1）灌胃8周后，與對(duì)照組相比，模型組大鼠的體重明顯降低（P<0.05），肝重明顯增加（P<0.05）。與模型組相比，低劑量組大鼠的體重明顯增加（P<0.05），肝重?zé)o明顯差異（P>0.05），高劑量組大鼠的體重明顯增加（P<0.05），肝重明顯降低（P<0.05）。與低劑量組相比，高劑量組大鼠體重明顯增加（P<0.05），肝重明顯降低（P<0.05）。高劑量組大鼠肝重與對(duì)照組無明顯差異（P>0.

6、05）。
　　2.各組大鼠肝臟指數(shù)（肝重/體重）計(jì)算結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組肝臟指數(shù)明顯升高（P<0.05）。與模型組相比，低劑量組和高劑量組肝臟指數(shù)均明顯降低（P<0.05）。與低劑量組相比，高劑量組肝臟指數(shù)明顯降低（P<0.05）。高劑量組肝臟指數(shù)明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。
　　3.肝功能指標(biāo)（TBIL/AST/ALT）檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組肝功能明指標(biāo)顯增加（P<0.05）。與模型組相比，GBE

7、給藥（高劑量組和低劑量組）能明顯降低肝功能指標(biāo)（P<0.05）。與低劑量組相比，高劑量組肝功能指標(biāo)明顯降低（P<0.05）。
　　4.肝纖維化指標(biāo)（HA/IV-C/LN/PⅢNP）檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組肝纖維化指標(biāo)明顯增加（P<0.05）。與模型組相比，GBE給藥（高劑量組和低劑量組）能明顯降低肝纖維化指標(biāo)（P<0.05）。與低劑量組相比，高劑量組高劑量組肝纖維化指標(biāo)明顯降低（P<0.05）。
　　5.對(duì)大鼠肝組

8、織作病理學(xué)檢查顯示，模型組較其它各組膠原沉積明顯增加，肝纖維化程度明顯加深（P<0.05）。GBE給藥（高劑量組和低劑量組）后，膠原沉積明顯減少，肝纖維化程度明顯改善，并且隨著GBE劑量增加，肝纖維化程度也明顯改善（P<0.05），但仍然沒有恢復(fù)到對(duì)照組水平。
　　6. Western blot實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，GBE給藥能夠有效地降低p38MAPK和p-p38MAPK的蛋白水平（P<0.05），表明 GBE能夠抑制肝纖維化大

9、鼠p38MAPK信號(hào)途徑。GBE給藥能夠有效地降低核內(nèi)蛋白（NF-κB）和增加胞質(zhì)蛋白（NF-κB、IκBα）水平（P<0.05），表明 GBE能夠調(diào)節(jié)肝纖維化大鼠 NF-κB/IκBα信號(hào)途徑。GBE給藥能夠有效地增加 Bcl-2蛋白水平（P<0.05），同時(shí)降低Bax和 Caspase-3蛋白水平（P<0.05），表明GBE能夠調(diào)節(jié)肝纖維化大鼠Bcl-2/Bax信號(hào)途徑。
　　7.免疫組化平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GBE給藥能夠有效地

10、降低 p38MAPK、Bax和NF-κB蛋白水平（P<0.05），同時(shí)增加Bcl-2蛋白水平（P<0.05），這與Western blot結(jié)果一致，表明 GBE能夠調(diào)節(jié)肝纖維化大鼠 p38MAPK信號(hào)途徑、NF-κB/IκBα信號(hào)途徑和Bcl-2/Bax信號(hào)途徑。
　　8. HSCs激活標(biāo)志因子（Colla1、Colla2、MMP-1、TIMP-1、α-SMA和Desmin） RNA水平檢測(cè)結(jié)果顯示，GBE給藥能夠有效地降低肝纖維

11、化大鼠HSCs激活因子RNA水平（P<0.05），表明GBE能夠抑制肝纖維化過程中HSCs的激活。
　　9.炎癥相關(guān)因子（Cox-2、IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β）RNA水平檢測(cè)結(jié)果顯示，GBE給藥能夠有效地降低肝纖維化大鼠炎癥相關(guān)因子 RNA水平（P<0.05），表明GBE能夠抑制肝纖維化過程中的炎癥反應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　GBE對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化具有有效的抑制作用。其潛在的作用機(jī)制可能包括