慢性乙型肝炎肝纖維化非創(chuàng)傷性診斷及肝纖維化進(jìn)展的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分HBeAg陰性慢性乙型肝炎肝纖維化非創(chuàng)傷性診斷模型的建立和應(yīng)用評價(jià)
　　目的:在HBeAg陰性的慢性乙型肝炎患者中建立基于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的肝纖維化非創(chuàng)傷性診斷模型，并評價(jià)其診斷肝纖維化的價(jià)值，為肝纖維化臨床診斷和療效評價(jià)提供依據(jù)。
　　方法:將349例具有肝活檢的HBeAg陰性慢性乙型肝炎患者隨機(jī)分為建模組(n=200)和驗(yàn)證組(n=149)。在建模組中，采用Logistic回歸和受試者操作特征(ROC)曲線等方法建

2、立診斷模型預(yù)測顯著性肝纖維化（S2-S4）和早期肝硬化(S4)。在驗(yàn)證組中，用ROC曲線等方法評價(jià)和比較該模型、APRI指數(shù)、Forns指數(shù)、S指數(shù)和FIB-4模型的診斷價(jià)值。
　　結(jié)果:在建模組中，將年齡、性別、凝血酶原時(shí)間、血小板計(jì)數(shù)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶及膽固醇這6個(gè)指標(biāo)聯(lián)合起來建立診斷模型。它能準(zhǔn)確的預(yù)測HBeAg陰性的慢性乙型肝炎患者有無顯著性肝纖維化和早期肝硬化，建模組ROC曲線下面積分別達(dá)到0.856和0.956。基于R

3、OC曲線，預(yù)測有無顯著性肝纖維化時(shí)，取0.22為陰性界值，0.75為陽性界值;預(yù)測有無早期肝硬化時(shí)，取0.95為陰性界值，0.98為陽性界值，能達(dá)到較好的診斷效果。相應(yīng)的在驗(yàn)證組中，該模型預(yù)測有無顯著性肝纖維化和早期肝硬化的ROC曲線下面積分別為0.889和0.937，優(yōu)于其他國內(nèi)外模型。使用建模組所得到的界值，可以準(zhǔn)確的預(yù)測40.9％的HBeAg陰性慢性乙型肝炎患者有無顯著性肝纖維化及91.3％的患者有無早期肝硬化。
　　結(jié)論:

4、該模型能夠準(zhǔn)確的區(qū)分HBeAg陰性的慢性乙型肝炎患者有無顯著性肝纖維化及早期肝硬化，減少臨床實(shí)踐中肝活檢的需要，具有較好的臨床應(yīng)用前景。
　　第二部分慢性乙型肝炎進(jìn)展中的差異基因表達(dá)譜研究
　　目的:應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測不同炎癥階段的慢性乙型肝炎患者肝組織的基因表達(dá)譜，篩選與慢性乙型肝炎炎癥進(jìn)展相關(guān)的差異基因，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探討慢性乙型肝炎進(jìn)展相關(guān)的分子機(jī)制。
　　方法:收集189例不同炎癥階段(G0-G4)

5、的慢性乙型肝炎患者肝活檢組織，Trizol一步法抽提總RNA。采用1％瓊脂糖凝膠電泳和芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab-on-chip)檢測RNA質(zhì)量。使用QIAGENRNeasyKit進(jìn)一步純化總RNA和cRNA。采用人類全基因組微陣列AffymetrixU133Plus2.0GeneChip檢測，應(yīng)用GeneSpring軟件對顯著差異基因、聚類、基因功能和信號通路進(jìn)行分析。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對其中5個(gè)差異基因的表達(dá)水平變化進(jìn)行驗(yàn)證和分析。

6、
　　結(jié)果:1％瓊脂糖凝膠電泳和Lab-on-chip電泳結(jié)果均提示抽提的總RNA質(zhì)量高，無降解現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合AffymetrixU133Plus2.0基因芯片質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，信號強(qiáng)度達(dá)到要求，檢測系統(tǒng)無異常，從而保證了雜交結(jié)果的可靠性。差異基因聚類分析結(jié)果顯示基因表達(dá)譜和病理學(xué)肝炎分級具有很好的相關(guān)性。將G1-G4組分別和G0組進(jìn)行比較，共篩選出570個(gè)顯著差異基因（P＜0.05）。G4/G0組間差異倍數(shù)≥2的上調(diào)和下調(diào)基因共

7、212個(gè)，主要是3大類功能基因（炎癥和免疫反應(yīng)相關(guān)的基因占40.68％，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因和結(jié)構(gòu)分子相關(guān)基因各占10.17％。信號通路分析結(jié)果顯示有120條信號通路顯著活化（P＜0.05），其中28條信號通路極顯著活化(P＜0.001)，包括自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的毒性相關(guān)的信號通路、T細(xì)胞受體信號通路和B細(xì)胞受體信號通路等。生物信息學(xué)分析顯示Jak-STAT通路處于通路網(wǎng)絡(luò)的核心位置，而CXCL10、STAT1、CCR2、CXCR4等是信號通

8、路間關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵基因。Real-timePCR驗(yàn)證結(jié)果和基因芯片所得數(shù)據(jù)相一致。
　　結(jié)論:慢性乙型肝炎的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，涉及諸多基因的表達(dá)變化，單一基因或信號通路不足以解釋其分子機(jī)制的全貌。采用基因芯片技術(shù)高通量、高效率的篩選炎癥進(jìn)展過程中差異表達(dá)的基因，對這些基因進(jìn)行系統(tǒng)的分析研究有助于闡明慢性乙型肝炎的發(fā)生機(jī)制、指導(dǎo)治療和評估預(yù)后。
　　第三部分視黃醇脫氫酶13(Rdh13)基因敲除對四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝

9、纖維化的作用及其機(jī)制研究
　　目的:本研究采用RdhJ13基因敲除小鼠來研究Rdh13在四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化過程中的作用及其機(jī)制。
　　方法:本研究所用的野生型和Rdh13基因敲除小鼠均為8-10周齡的129/Sv和C57BL/6雜交系小鼠。以四氯化碳誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷和慢性肝損傷所致肝纖維化模型。檢測肝臟的組織學(xué)和肝纖維化的關(guān)鍵標(biāo)志物。在四氯化碳損傷后不同時(shí)間點(diǎn)，應(yīng)用Real-timePCR、WesternBlot和免疫

10、組化方法檢測小鼠肝組織肝星狀細(xì)胞活化標(biāo)記α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、(Ⅰ)型膠原、金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、血小板源性生長因子(PDGF)和一些細(xì)胞黏附分子（細(xì)胞間黏附分子-1，血管細(xì)胞間黏附分子-1和纖維連接蛋白）的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:CC14急性肝損傷在野生型和Rdh13基因敲除小鼠都建立了一個(gè)促肝纖維化發(fā)生的環(huán)境，包括肝星狀細(xì)胞的激活，Ⅰ型膠原、TIMP-1、主要的

11、促纖維化分子(TGF-β1，PDGF)及細(xì)胞黏附分子(ICAM-1，VCAM-1，fibronectin)的表達(dá)上調(diào)。而且與Rdh13基因敲除小鼠相比，該反應(yīng)在野生型小鼠中更劇烈。CC14慢性肝損傷后，野生型和Rdh13基因缺失小鼠肝纖維化模型均成功建立。但是，與Rdh13基因敲除小鼠相比，野生型小鼠的肝纖維化程度較高，與之相伴隨的是肝星狀細(xì)胞激活的數(shù)量和膠原沉積較多，TIMP-1、TGF-β1、PDGF及細(xì)胞黏附分子表達(dá)上調(diào)較多。