血清（血漿）miRNA對慢性乙型肝炎肝纖維化非創(chuàng)傷性診斷價(jià)值的臨床研究.pdf

1、第一章慢性乙型肝炎肝纖維化進(jìn)程中差異表達(dá)循環(huán)miRNA的篩選
　　目的：本研究旨在尋找在慢性乙型肝炎肝纖維化各分期分組之間差異表達(dá)的血清（血漿）miRNA,為發(fā)現(xiàn)乙肝肝纖維化非創(chuàng)傷性診斷標(biāo)志物及組建診斷模型奠定基礎(chǔ)。
　　方法：研究材料為2012年7月-2013年12月間于上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院行肝活檢的慢性HBV感染患者血漿樣本共50例（肝纖維化Scheuer分期S0-S4期各10例），提取血清（血漿）miRNA，并

2、采用安捷倫公司人類miRNA芯片v18.0（Affymetrix Human v18.0）進(jìn)行miRNA芯片雜交、掃描及數(shù)據(jù)提取。應(yīng)用Quantile歸一化法進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，主要采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、ANOVA分析S0-S4組間、非顯著性肝纖維化和顯著性肝纖維化組間（S0-1/S2-4）、輕度肝纖維化和重度肝纖維化(S0-1/S3-4)組間 miRNA的差異表達(dá)。
　　結(jié)果：從芯片結(jié)果來看，S1-S4組分別與S0組比較,差異倍數(shù)大

3、于2倍的miRNA共有140個(gè)（p<0.05）；在非顯著性肝纖維化(S0-1)和顯著性肝纖維化(S2-4)兩組間差異表達(dá)達(dá)2倍以上的miRNA共有11個(gè)；重度纖維化組（S3-4）與輕度纖維化組（S0-1）相比，差異倍數(shù)達(dá)2倍以上的miRNA共有7個(gè)。因hsa-miR-1225-3p，hsv1-miR-H7-3p，hsa-miR-1238-3p，hsa-miR-3162-3p，hsa-miR-4721在輕度纖維化/明顯纖維化組間表達(dá)倍數(shù)達(dá)

4、3-5倍以上，且在不同的分組比較中均有差異，我們擬定上述miRNAs作為候選差異miRNA進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)時(shí)熒光定量驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)論：采用血清（血漿）miRNA芯片技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)miRNA表達(dá)譜的變化與肝纖維化分期密切相關(guān)，該研究為肝纖維化無創(chuàng)性診斷物的開發(fā)和應(yīng)用提供了可能。
　　第二章慢性乙型肝炎肝纖維化相關(guān)差異表達(dá)miRNA的驗(yàn)證、診斷模型的建立及評估
　　目的：本研究旨在對miRNA芯片實(shí)驗(yàn)篩選的5個(gè)miRNA

5、進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，同時(shí)應(yīng)用logistic回歸方法優(yōu)化組合各miRNA，建立顯著性肝纖維化（S2-4）的預(yù)測診斷模型，評估該模型診斷效能并進(jìn)一步與其他預(yù)測模型（APRI評分、Forn's評分、FIB-4評分、S指數(shù)）在預(yù)測診斷價(jià)值方面進(jìn)行比較。
　　方法：本部分的研究材料入選標(biāo)準(zhǔn)同第一部分實(shí)驗(yàn)，均來自上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院，收集時(shí)間為2012年7月至2014年12月間，病例組血清（血漿）共83份（SO組10份，S1組15份，S

6、2組13份，S3組10份，S4組10份，肝硬化代償組13份，肝硬化失代償組12份）及正常對照組血漿（血清）標(biāo)本20份進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。本階段我們用Taqman qRT-PCR方法在103份樣本中驗(yàn)證5個(gè)候選miRNA的穩(wěn)定性，獲得5個(gè)miRNA相對表達(dá)量后，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析其在非顯著性肝纖維化(S0-1)/顯著性肝纖維化(S2-4)、肝纖維化/肝硬化組、代償期肝硬化/失代償期肝硬化組間的差異，從結(jié)果中進(jìn)一步篩選目標(biāo)m

7、iRNA，并使用logistic回歸模型對其進(jìn)行優(yōu)化組合獲得診斷模型，繪制診斷模型的ROC曲線及計(jì)算AUROC來判斷該模型的診斷價(jià)值，并同時(shí)與診斷模型Forns指數(shù)、APRI指數(shù)、FIB-4評分以及S指數(shù)進(jìn)行診斷效能的比較。
　　結(jié)果：5個(gè)候選miRNA在顯著性肝纖維化組/非顯著性肝纖維化組組間表達(dá)水平有顯著性差異（p<0.05），hsa-mir-1225-3p，hsa-mir-1238，hsa-miR-3162-3P，hsa-m

8、iR-4721，hsa-miR-H7上調(diào)倍數(shù)分別為：10、10.23、16、4.85、4.7，與芯片結(jié)果基本相符，但上述miRNA對肝纖維化/肝硬化組、代償期肝硬化/失代償期肝硬化組間區(qū)分度不高。我們通過建立受試者工作特征曲線(Receiver Operating Characteristic Curve,ROC曲線),進(jìn)行計(jì)算ROC曲線下面積(Area Under Curve，AUC)對每個(gè) miRNA的診斷能力進(jìn)行判斷，得到 miR

9、NA-3162，miRNA-1225，miRNA-1238，miRNA-4721，miRNA-H7的AUROC面積分別為0.899,0.852,0.656,0.650,0.650，可見miRNA-3162，miRNA-1225對明顯肝纖維化診斷效能極強(qiáng)，而miRNA-1238，miRNA-4721，miRNA-H7診斷價(jià)值較為一般。為進(jìn)一步優(yōu)化診斷效能，我們對上述5個(gè)miRNA進(jìn)行逐步logistic回歸，得到診斷方程式MiR-5=1.

10、115*miR1225+0.157*miR1238+6.256*miR3162+0.072*miR4721-0.831miRH7-2.729。同樣通過 ROC曲線下面積評估其診斷效能,其區(qū)分明顯肝纖維化和輕度肝纖維化的AUC為0.909，診斷效能優(yōu)于Forns指數(shù)、APRI指數(shù)、FIB-4評分和S指數(shù)等預(yù)測模型及單個(gè)差異miRNA。
　　結(jié)論：采用Taqman qRT-PCR技術(shù)，我們驗(yàn)證hsa-mir-1225-3p，hsa-m