慢性乙型肝炎肝纖維化的無創(chuàng)診斷與機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是一個世界性的公共健康問題（共計約四億人口）。大多數(shù)慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者均有不同程度的肝纖維化病理改變。肝纖維化作為一組慢性進(jìn)展性肝損傷反應(yīng)，若不及時診治，極有可能發(fā)展為肝硬化乃至肝癌。各個乙肝防治指南一致推崇顯著性肝纖維化（S≥2）作為抗病毒治療的重要指征，爭取肝纖維化是在早期肝硬化可以得到逆轉(zhuǎn)。因而

2、，肝纖維化、肝硬化的早期診斷顯得尤為重要。肝組織活檢雖為金標(biāo)準(zhǔn)，但局限性也顯而易見。肝纖維化無創(chuàng)性診斷方法（包括FibroScan與血清學(xué)指標(biāo)或模型）由此應(yīng)運(yùn)而生，在診斷慢性乙型病毒性肝炎患者纖維化方面體現(xiàn)出一定價值。本研究擬在大樣本基礎(chǔ)上評估FibroScan、肝纖維化血清學(xué)模型(AAR、API、APRI、GPRI、S index、FIB-4與Fibro-Q)單獨(dú)或聯(lián)合診斷顯著性肝纖維化的診斷準(zhǔn)確度，挑選出更適合基層社區(qū)醫(yī)院診斷肝纖維

3、化的血清學(xué)模型，并分析炎癥活動對FibroScan結(jié)果的影響。同時，尋找新的與肝纖維化程度相關(guān)的血清細(xì)胞因子，評估其診斷顯著性肝纖維化的效能;進(jìn)一步探索這類與纖維化相關(guān)的因子（本研究中為MIP-3α）所具有的潛在致纖維化機(jī)制。
　　方法:
　　第一部分:無創(chuàng)模型診斷肝纖維化價值的研究
　　收集來我院同時行肝臟穿刺檢查、FibroScan與實(shí)驗(yàn)室檢查的CHB患者的臨床資料與血清標(biāo)本（各檢查間隔時間不超過2天）。參照200

4、0年《病毒性肝炎防治方案》，進(jìn)行肝組織的纖維化分期(S0～S4)以及炎癥分級(G0～G4)，分別評估FibroScan、肝纖維化血清學(xué)模型(AAR、API、APRI、GPRI、S index、FIB-4與Fibro-Q)診斷顯著性肝纖維化(S≥2)的價值，并分析炎癥分級對FibroScan結(jié)果的影響。
　　第二部分:肝纖維化血清標(biāo)志物的篩選
　　蛋白芯片初篩的8例患者包括CHB患者4例，CHB相關(guān)性肝硬化4例。共篩選507個

5、因子，以期從中獲得兩組之間存在差異性表達(dá)的因子。
　　酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA)主要篩選2012年3月至2013年11月間第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院于兩日內(nèi)同時行肝穿刺術(shù)、FibroScan以及實(shí)驗(yàn)室檢查的CHB患者。研究對象分為健康志愿者、非顯著性肝纖維化者以及顯著性肝纖維化者。檢測指標(biāo)包括巨噬細(xì)胞炎性蛋白-3α（MIP-3α）、轉(zhuǎn)化生長因子β以及血小板衍生生

6、長因子-BB(PDGF-BB)。
　　第二部分:MIP-3α對肝星狀細(xì)胞活性與增殖的影響
　　采用體外培養(yǎng)人肝星狀細(xì)胞LX-2，將細(xì)胞分為空白對照組和不同濃度MIP-3α共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組。24小時后，運(yùn)用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液PDGF-BB的含量，MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。
　　結(jié)果:
　　第一部分:無創(chuàng)模型診斷肝纖維化價值的研究
　　1.FibroScan、S index、GPRI、FIB-4、AP

7、RI、API、Fibro-Q及AAR診斷顯著性肝纖維化的AUROC依次為0.757(P＜0.001)、0.726(P＜0.001)、0.726(P＜0.001)、0.621(P=0.001)、0.619(P=0.001)、0.580(P=0.033)、0.569(P=0.066)及0.495(P=0.886)。
　　2.FibroScan聯(lián)合S index以及GPRI診斷顯著肝纖維化的AUROC依次為0.753(P＜0.001)、

8、0.740(P＜0.001)。
　　3.FibroScan在不同炎癥分級階段(G0、G1、G2、G3、G4)診斷顯著性肝纖維化的AUROC分別為0.8267(P＜0.001)、0.6956(P＜0.001)、0.7092(P=0.0012)與0.6947(P=0.137)。
　　4.肝硬度值在非顯著性肝纖維化患者呈顯著性增加(G0 vs.G1，P=0.051; G1vs.G2，P=0.005;G2vs.G3，P＜0.001)

9、;而在顯著性纖維化患者中，雖然肝硬度值在升高，但相鄰兩組之間并無統(tǒng)計學(xué)差異(G0 vs.G1，P=0.135; G1 vs.G2，P=0.294; G2vs.G3, P=0.260; G3vs.G4， P=0.056)。
　　第二部分:肝纖維化血清標(biāo)志物的篩選
　　1.在肝硬化與非肝硬化的CHB患者對比中，有下列12種蛋白因子存在顯著差異性(P＜0.05):β-鏈蛋白、CD27、CD163、內(nèi)皮素、人粒細(xì)胞趨化蛋白-2、白介

10、素IL-12 P40、巨噬細(xì)胞游走抑制因子、組織因子途徑抑制素、尿激酶型纖溶酶原激活劑、血管內(nèi)皮生長因子以及Wnt誘導(dǎo)的分泌型蛋白1。
　　2.MIP-3α具有診斷顯著性肝纖維化的作用(AUROC=0.724，P＜0.001)。
　　第三部分:MIP-3α對肝星狀細(xì)胞活性與增殖的影響
　　當(dāng)共培養(yǎng)的MIP-3α濃度依次為0 ng/ml、250 ng/ml、500 ng/ml、1μg/ml、2μg/ml時，ELISA法檢

11、測細(xì)胞培養(yǎng)上清液PDGF-BB對應(yīng)的光吸收平均值分別為0.0608、0.2533、0.1112、0.0561以及0.0581; MTT法檢測細(xì)胞增殖情況，相應(yīng)的光吸收平均值分別為1.6550、0.9670、1.1319、1.1405以及1.2157。
　　結(jié)論:
　　1.FibroScan診斷慢性乙型肝炎肝纖維化準(zhǔn)確度較高，但臨床應(yīng)用時易受肝臟炎癥活動的影響。
　　2.較我們評估的其他血清學(xué)模型，GPRI與S inde