reversine對大鼠肝纖維化的治療及相關(guān)機制的初步研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、背景:
  肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是肝臟受到慢性炎癥等多種因素損傷所致,呈現(xiàn)為細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)的合成大于降解,從而導致肝內(nèi)ECM過度沉積的病理生理改變。肝纖維化是肝硬化發(fā)生的必經(jīng)中間環(huán)節(jié),肝硬化目前是我國肝病的常見疾病和主要死亡病因之一,其持續(xù)發(fā)展已嚴重危害人類健康。每年我國約有30萬人死于肝硬化相關(guān)性疾病,基于以上現(xiàn)狀,早期積極的抗纖維化治療有可能阻止其向肝

2、硬化發(fā)展。干預(yù)肝纖維化發(fā)展為失代償肝硬化和肝癌,以提高生活質(zhì)量和生存率,具有重要的臨床意義。我們在近期研究中發(fā)現(xiàn)一種名為reversine的小分子藥物可能夠讓高度分化的成熟細胞回復到脫分化的狀態(tài)并具有促使細胞返老還童的功能。由此我們構(gòu)想 reversine能否對肝纖維化具有治療作用?這種作用是否能通過抑制肝星狀細胞(Hepatic stellate cell,HSC)的增殖并誘導其凋亡而實現(xiàn)?我們擬在體外檢測reversine對HSC的

3、相關(guān)作用,同時在體內(nèi)驗證 reversine對肝纖維化模型大鼠的效果,以期明確藥物效果,為其治療肝纖維化提供實驗依據(jù)。
  目的:
  探討小分子藥物reversine對大鼠肝纖維化模型的影響及其作用機制。
  方法:
  1.肝纖維化模型建立及B超監(jiān)測:健康雄性SD大鼠采用硫代乙酰胺皮下注射建立肝纖維化模型;建模過程中進行超聲彈性成像動態(tài)監(jiān)測,使用聲觸診組織量化技術(shù)(VTQ)來測量肝臟組織橫向剪切波速度(Vs值

4、)。建模結(jié)束,進行標本采集與保存、H&E染色、α-SMA免疫組化并應(yīng)用ImageJ圖像系統(tǒng)分析,最后進行肝臟纖維化程度綜合評分。
  2.離體消化、密度梯度法分離大鼠原代 HSC:通過離體灌注消化,Nycodenz密度梯度液分離大鼠原代HSC,熒光顯微鏡下觀察其形態(tài),接種培養(yǎng)及消化傳代、最后進行α-SMA免疫熒光鑒定。
  3.在體外研究reversine對HSC的相關(guān)作用:多維活細胞顯微鏡下觀察reversine體外對大鼠

5、HSC的作用,CCK-8檢測reversine對大鼠HSC的增殖的影響,酶標儀波長450nm處測定OD值,并計算刺激率。
  4.在體內(nèi)研究reversine對肝纖維化模型大鼠的作用:健康雄性SD大鼠采用硫代乙酰胺皮下注射建立肝纖維化模型,并進行皮下注射 reversine溶液250μg/kg三周進行干預(yù);建模及治療過程中均進行超聲彈性成像動態(tài)監(jiān)測,使用聲觸診組織量化技術(shù)(VTQ)來測量肝臟組織橫向剪切波速度(Vs值)。治療結(jié)束,

6、進行標本采集與保存、H&E染色、α-SMA免疫組化并應(yīng)用ImageJ圖像系統(tǒng)分析,最后進行肝臟綜合評分,綜合以上結(jié)果評估藥效。
  結(jié)果:
  1.肝纖維化模型建立及B超監(jiān)測:正常組大鼠B超彈性成像Vs值為1.18±0.181,實驗組大鼠B超彈性成像Vs值為2.47±0.511。肝纖維化的程度與彈性成像Vs值呈正性相關(guān),P<0.01具有統(tǒng)計學意義。H&E染色顯示正常組大鼠肝組織顯示匯管區(qū)、肝細胞形態(tài)完整,未見明顯炎性反應(yīng)、變

7、性及壞死,實驗組大鼠肝組織顯示正常肝小葉的結(jié)構(gòu)被破壞或消失,肝組織排列紊亂,肝細胞腫脹及炎癥明顯,纖維橋接形成;肝纖維化免疫組化α-SMA顯示正常組大鼠肝組織顯示肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、并無膠原纖維增生,實驗組大鼠肝組織顯示肝小葉結(jié)構(gòu)破壞、匯管區(qū)擴大,肝匯管區(qū)及其周圍出現(xiàn)纖維橋接形成、可見大量棕黃色呈陽性表達的間質(zhì)細胞;應(yīng)用ImageJ圖像系統(tǒng)分析,正常組含有α-SMA的面積為7.052±2.730、實驗組含有α-SMA的面積為193.037±

8、16.318;各組大鼠肝臟的病理分期:正常組大鼠肝臟均在S0期,實驗組大鼠肝臟均在S2-S3期,實驗組大鼠均呈現(xiàn)不同程度的肝纖維化。
  2.離體消化、密度梯度法分離大鼠原代HSC:通過離體灌注消化,Nycodenz密度梯度液成功分離出大鼠原代HSC,每只大鼠HSC的得率大約為1.2-2.0×10^7/只。觀察剛分離的HSC呈圓形,胞漿中含有較多脂滴,折光性強,在熒光顯微鏡下觀察,呈自發(fā)藍綠色熒光。免疫細胞熒光染色顯示α-SMA陽

9、性染色達91.90%。
  3.在體外研究reversine對HSC的相關(guān)作用:reversine濃度25ng/ml,干預(yù)HSC10小時,可見HSC細胞形態(tài)發(fā)生改變,細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落,連接消失,核質(zhì)濃縮。reversine以不同濃度干預(yù)HSC并加入CCK-8試劑10μl,在37℃分別溫育4h,reversine25ng/ml組、reversine50ng/ml組、reversine75ng/ml組刺激率分別為8.56%、1

10、0.77%、18.31%。在reversine25ng/ml干預(yù)HSC10小時后,能較好的抑制HSC的增殖作用,且隨著濃度的升高,抑制HSC的增殖作用更加明顯,呈正性相關(guān)(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義。
  4.在體內(nèi)研究reversine對肝纖維化模型大鼠的作用:正常組大鼠B超彈性成像Vs值為1.23±0.180,實驗組為2.27±0.231,reversine治療組為1.18±0.139。肝纖維化的程度與彈性成像Vs值呈正

11、性相關(guān),而reversine治療組Vs值明顯小于實驗組,P<0.01具有統(tǒng)計學意義。H&E染色顯示治療組肝組織顯示匯管區(qū)出現(xiàn)纖維組織增生較實驗組明顯減少,肝假小葉周圍出現(xiàn)膠原纖維也有所減少,肝索排列混亂有所改善,肝細胞腫脹減輕,未見明顯灶性壞死。免疫組化α-SMA顯示治療組的肝小葉結(jié)構(gòu)破壞有所修復,匯管區(qū)縮小,可見不完整的淡黃棕色的間質(zhì)細胞。應(yīng)用ImageJ圖像系統(tǒng)分析,正常組含有α-SMA的面積為20.196±5.835,實驗組含有α

12、-SMA的面積為189.636±28.322,治療組含有α-SMA的面積為72.195±25.141。治療組與實驗組比較,肝星狀細胞的表達顯著減少(P<0.01),差異有統(tǒng)計學意義。各組大鼠肝臟的病理分期:正常組大鼠肝臟均在S0期,實驗組大鼠肝臟均在S2-S3期,經(jīng)reversine治療后,治療組大鼠肝臟均降期在S1期。
  結(jié)論:
  1.我們在B超彈性成像動態(tài)監(jiān)測下,利用硫代乙酰胺成功建立了大鼠肝纖維化模型。在該模型中,

13、肝臟中肝星狀細胞的含量明顯較正常肝臟的含量增多的。
  2.通過對大鼠的肝臟采用原位灌注消化法和Nycodenz密度梯度離心法,成功分離出大鼠原代HSC。
  3. reversine在細胞體外,對HSC增殖有明確的抑制作用。reversine在25 ng/ml作用10小時,開始達到最佳抑制效果,使HSC細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落,表現(xiàn)出細胞凋亡的形態(tài)改變。
  4. reversine可在大鼠肝纖維化模型中,可通過降低

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