高密度培養(yǎng)骨髓細(xì)胞治療大鼠肝纖維化及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　建立一種穩(wěn)定的wistar大鼠慢性肝纖維化模型。通過(guò)脾臟注射高密度培養(yǎng)骨髓細(xì)胞，觀察移植細(xì)胞能否改善大鼠肝纖維化，并研究其阻止肝臟慢性纖維化進(jìn)展可能的作用機(jī)制，探討高密度培養(yǎng)骨髓細(xì)胞治療慢性肝纖維化的應(yīng)用價(jià)值。
　　方法:
　　1.通過(guò)四氯化碳(CCl4)腹腔注射，建立wistar大鼠慢性肝纖維化模型;
　　2.將建模成功大鼠隨機(jī)分成三組，高密度培養(yǎng)組(HD)、常規(guī)密度培養(yǎng)組(RD)和PBS組。經(jīng)脾臟

2、分別注射經(jīng)過(guò)熒光素CM-DiL標(biāo)記的2×106的骨髓HD細(xì)胞、RD細(xì)胞和200μl PBS;
　　3.血清分析檢測(cè)大鼠肝功能指標(biāo);苦味酸天狼星紅(PSR)和Masson染色檢測(cè)肝臟中膠原合成與分布;免疫組化檢測(cè)肝臟中Ⅰ型膠原、α-SMA的表達(dá)，qRT-PCR檢測(cè)組織中α2-procollagen、α-SMA、fibronectin和TGF-β的基因表達(dá);
　　4.組織冰凍切片后行Ⅰ型膠原免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察CM-D

3、iL陽(yáng)性的移植細(xì)胞在肝臟組織中的數(shù)量及分布情況;
　　5.肝臟組織切片行Ki-67、CD31免疫組化法染色，觀察細(xì)胞增殖與血管生成;qRT-PCR檢測(cè)組織中肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的基因表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.重復(fù)多次腹腔注射CCl4，可以建立穩(wěn)定的大鼠慢性肝纖維化模型。
　　2.大鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)高密度培養(yǎng)后，細(xì)胞高表達(dá)CD31、CD133和KDR，體外成管實(shí)驗(yàn)顯示高密度培養(yǎng)細(xì)

4、胞比普通密度培養(yǎng)細(xì)胞具有更強(qiáng)的成管能力，提示高密度培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞富含血管內(nèi)皮前體細(xì)胞。
　　3.造模大鼠血清谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶明顯增高，白蛋白降低，PBS治療組無(wú)明顯改善，細(xì)胞移植組血清谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶降低，白蛋白升高，HD組優(yōu)于RD組，提示高密度培養(yǎng)細(xì)胞的作用更好。
　　4.造模大鼠肝臟HE染色發(fā)現(xiàn)肝臟重構(gòu)，假小葉形成，細(xì)胞移植后假小葉減少，PSR和Masson染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外膠原沉積減少。免疫組化分析顯示細(xì)胞移植

5、組肝臟中Ⅰ型膠原和α-SMA的表達(dá)減少，qRT-PCR檢測(cè)顯示細(xì)胞移植組α2-procollagen、α-SMA和fibronectin的基因表達(dá)降低，HD組優(yōu)于RD組。
　　5.肝臟組織免疫組化染色顯示HD組中CD31陽(yáng)性的血管多于RD組，Ki67陽(yáng)性的增殖細(xì)胞數(shù)多于RD組，肝臟組織qRT-PCR檢測(cè)顯示促肝細(xì)胞增殖的HGF和促血管生成的VEGF基因在HD組中表達(dá)明顯高于RD組。
　　結(jié)論:
　　骨髓高密度培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)