局部高密度擴(kuò)增骨髓內(nèi)成血管類祖細(xì)胞及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、干細(xì)胞體外擴(kuò)增和干性維持是本領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)，已知體內(nèi)干細(xì)胞特性維持與自我更新依靠其所處的微環(huán)境，其中干細(xì)胞之間，以及與周圍細(xì)胞的接觸與信息交換起著重要的作用，而傳統(tǒng)體外干細(xì)胞培養(yǎng)方法破壞了細(xì)胞間的接觸與信息交換，降低了擴(kuò)增效率。我們提出了局部高密度細(xì)胞接種的設(shè)想，通過高密度接種骨髓細(xì)胞的方法來增加細(xì)胞之間的相互接觸，達(dá)到擴(kuò)增骨髓中成血管類祖細(xì)胞的目的。
　　目的：
　　本研究旨在通過局部高密度培養(yǎng)增加細(xì)胞-細(xì)胞間接觸，

2、進(jìn)而達(dá)到擴(kuò)增骨髓中成血管類祖細(xì)胞的目的，并通過基因芯片分析，定量PCR等手段，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證與高密度培養(yǎng)相關(guān)的特異性分子，闡明高密度培養(yǎng)擴(kuò)增并維持成血管類祖細(xì)胞特性的可能機(jī)制。該研究將解決骨髓成血管類祖細(xì)胞體外擴(kuò)增難題，并為研究細(xì)胞-細(xì)胞接觸建立重要的體外研究模型。
　　方法：
　　我們從wistar大鼠的股骨與脛骨中取出骨髓，進(jìn)行原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的細(xì)胞消化后，以2×105/cm2為密度點(diǎn)狀接種直徑10cm培養(yǎng)皿，均勻分布6點(diǎn)

3、接種，每皿細(xì)胞總量9×105，以相同數(shù)量細(xì)胞均勻接種于相同大小培養(yǎng)皿作為普通密度培養(yǎng)對照組。在培養(yǎng)15天后，我們通過流式細(xì)胞術(shù)對傳統(tǒng)密度已經(jīng)局部高密度培養(yǎng)出的骨髓細(xì)胞進(jìn)行表型的鑒定，并在體外與體內(nèi)驗(yàn)證了局部高密度培養(yǎng)得到的細(xì)胞與傳統(tǒng)密度培養(yǎng)得到的細(xì)胞在血管再生能力上的差異。
　　結(jié)果：
　　流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示與傳統(tǒng)密度相比，局部高密度培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞與原代細(xì)胞的表型更為接近，高表達(dá)CD14（35.7％），CD133（47.5

4、%），CD45（49.9%）,KDR（32.9%），CD144（34.5%），CD31（36%）與CD34（7.5%）這些與造血和成血管類祖細(xì)胞密切相關(guān)的表面標(biāo)志，顯示了局部高密度培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞可能具有很強(qiáng)的血管再生能力。
　　我們通過在matrigel上的成管實(shí)驗(yàn)證明了局部高密度培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞在體外具有更加良好的血管形成能力，結(jié)果顯示傳統(tǒng)密度形成的分支節(jié)點(diǎn)數(shù)為7.2個(gè)，而局部高密度形成的分支節(jié)點(diǎn)數(shù)為29.8個(gè)。
　　我們通

5、過對下肢缺血裸鼠的細(xì)胞治療來證明了局部高密度擴(kuò)增細(xì)胞具有更好的潛在治療價(jià)值。結(jié)果顯示下肢缺血裸鼠治療三周后，局部高密度治療組能夠更好的改善缺血裸鼠的預(yù)后：出現(xiàn)下肢壞死的比例為30%，作為對照PBS組壞死率為100%，傳統(tǒng)密度組壞死率為90%。下肢血流改變反映了同樣的趨勢：高密度治療組3周后患/健血流比為0.82，而PBS組與傳統(tǒng)密度組患/健血流比分別為0.4與0.53。我們檢測了缺血下肢肌肉內(nèi)的血管密度，結(jié)果顯示高密度治療組的血管密度為

6、776.9/mm2，而PBS組與傳統(tǒng)密度組血管密度分別為400/mm2與423.4/mm2。
　　最后我們通過基因芯片以及定量PCR的方法初步探討了局部高密度擴(kuò)增骨髓內(nèi)成血管類祖細(xì)胞的可能機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示局部高密度擴(kuò)增的細(xì)胞高表達(dá)整合素類相關(guān)表面分子，整合素類分子與細(xì)胞接觸密切相關(guān)，同時(shí)也可以影響細(xì)胞的成血管能力，因此可能整合素類分子的上調(diào)在局部高密度擴(kuò)增成血管類祖細(xì)胞中起到了重要的作用。另外我們發(fā)現(xiàn)了在局部高密度培養(yǎng)體系，一些

7、與血管再生密切相關(guān)的生長因子無論在基因還是在蛋白上的表達(dá)均明顯高于傳統(tǒng)密度培養(yǎng)體系，這提示生長因子的差異也可能是局部高密度擴(kuò)增成血管干細(xì)胞的可能機(jī)制之一。
　　結(jié)論：
　　局部高密度培養(yǎng)大鼠骨髓細(xì)胞可以擴(kuò)增出骨髓中的成血管類祖細(xì)胞，這些細(xì)胞具有很強(qiáng)的體內(nèi)外形成血管的能力并具有很好的治療缺血性疾病的價(jià)值。這些成血管類祖細(xì)胞在局部高密度體系內(nèi)的擴(kuò)增可能與整合素相關(guān)分子的上調(diào)，細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)分子的上調(diào)以及成血管類生長因子的高表達(dá)有