藥物修飾內皮祖細胞對內皮修復及相關機制的研究.pdf

1、研究目的： 預防和治療再狹窄是當今研究的熱點。再狹窄形成的始動因素是內皮損傷和剝脫，然而成熟內皮細胞修復能力有限，而近來發(fā)現(xiàn)內皮祖細胞(EPCs)是進行內皮修復的種子細胞。由于EPCs在疾病狀態(tài)或冠心病危險因素存在時，數(shù)量不但減少，而且存在功能低下。 第一部分：高膽固醇血癥兔外周血內皮祖細胞的培養(yǎng)特性及相關機制的研究 材料與方法： 12只雄性新西蘭大白兔分為2組：正常組和高膽固醇血癥組。從兔耳中央動脈抽取

2、的血按密度梯度離心法分離單個核細胞，EBM-2培養(yǎng)基(含20％胎牛血清，EGM-2MVSingLeQuots)培養(yǎng)3-4周。采用雙熒光染色法、流式鑒定和免疫組化鑒定細胞為EPCs。MTT法、黏附能力檢測和Griess法測定細胞增殖、黏附、分泌一氧化氮(NO)的能力。比色法測定細胞超氧陰離子(O2-)的濃度、內皮型一氧化氮合成酶(eNOS)和NADPH氧化酶的活性。RT-PCR法檢測細胞eNOS和NADPH氧化酶p22phox的mRNA表

3、達。 結果： 細胞流式儀發(fā)現(xiàn)體外分離培養(yǎng)的細胞高表達CD34，免疫組化法進一步發(fā)現(xiàn)該類細胞還可表達內皮系特異標志vWF；同時該類細胞也能攝取ac-LDL和結合UEA-1，提示本實驗已成功分離和體外培養(yǎng)出兔外周血EPCs。 結論： 高膽固醇血癥時EPCs的數(shù)量減少和功能(增殖、遷移和分泌)受損；氧化應激參與影響其數(shù)量和功能。 第二部分：羅格列酮和阿托伐他汀對兔內皮祖細胞數(shù)量和功能的影響 材料

4、與方法：動物分組、EPCs的鑒定和培養(yǎng)同第一部分實驗。 結果： 1.0.01μM至1μM濃度時，羅格列酮呈濃度依賴性提高高膽固醇血癥兔EPCs的數(shù)量、增殖、黏附和分泌VEGF及NO功能。而10μM羅格列酮未進一步提高EPCs數(shù)量和功能。 2.0.01μM至1μM濃度時，阿托伐他汀呈濃度依賴性提高高膽固醇血癥兔EPCs的數(shù)量、增殖、黏附和分泌VEGF及NO功能。而10μM阿托伐他汀未進一步提高EPCs數(shù)量和功能。

5、 3.1μM羅格列酮聯(lián)合1μM阿托伐他汀組，較1μM阿托伐他汀和1μM羅格列酮更進一步提高EPCs的數(shù)量(50.50±4.04vs45.98±5.08，44.08±3.70，P＜0.05)和功能(增殖：0.61±0.02vs0.52±0.03和0.50±0.03，P＜0.05；黏附：40.67±2.08vs30.67±1.53和30.67±0.58，P＜0.05；分泌：VEGF,120.76±12.59vs88.10±12.52和

6、84.25±13.75，P＜0.05)，對分泌NO功能雖無顯著進一步增強(24.74±4.27vs18.16±1.70和15.05±2.85，P＞0.05)，但有增加的趨勢。 4.1μM阿托伐他汀和1μM羅格列酮均可分別使高膽固醇血癥組eNOS表達增加60％和23％。兩者聯(lián)合干預則使表達增加94％，較單藥增加更為明顯(P＜0.05)，且與正常組無差異(P＞0.05)。 結論： 羅格列酮聯(lián)合阿托伐他汀可協(xié)同提高EP

7、Cs數(shù)量和改善功能，實現(xiàn)體外對EPCs進行“藥物修飾”。 第三部分：羅格列酮聯(lián)合阿托伐他汀修飾內皮祖細胞移植對內皮修復的研究 材料與方法： 25只雄性新西蘭大白兔隨機分為4組：正常組(N，n=10)、損傷未干預組(C，n=8)、EPCs移植組(E，n=8)和藥物干預EPCs移植組(ME，n=8)。藥物干預EPCs指EPCs經(jīng)1μM羅格列酮聯(lián)合1μM阿托伐他汀預處理24小時。 結果： 1.EPCs移

8、植組和藥物干預EPCs移植組在熒光顯微鏡下均發(fā)現(xiàn)損傷部位有Dil標記的移植的EPCs。而正常組與損傷未干預組未見熒光細胞表達。表明EPCs歸巢于受損血管處。 2.EPCs移植組的再內皮化率較未損傷干預組顯著提高(75.57±4.03％vs51.66±1.69.P＜0.05％)，而藥物干預組則進一步提高(93.38±2.41％vs75.57±4.03％，P＜0.05)。 3.與正常組相比，損傷未干預組I/M顯著升高(1.8

9、0±0.16vs0.28±0.03，P＜0.05)；EPCs移植組I/M較損傷未干預組顯著降低(1.31±0.22vs1.80±0.16，P＜0.05)；而藥物干預EPCs移植組則使I/M進一步降低(0.51±0.08vs1.31±0.22，P＜0.05)。 4.與正常組相比，未損傷干預組α-SMA表達顯著增加，EPCs移植組使α-SMA表達下降，而藥物干預EPCs移植組則進一步下降。 結論： EPCs移植可以定

10、位于頸動脈損傷段，加速內皮修復，抑制內膜增生，延緩再狹窄。藥物修飾EPCs移植可進一步加速再內皮化，提高抑制內膜增生療效和防治再狹窄。 第四部分：羅格列酮和阿托伐他汀動員內皮祖細胞對內皮修復的影響及相關機制的研究 材料與方法： 40只雄性新西蘭大白兔隨機分為5組：正常組(n=8)、損傷未干預組(n=8)、羅格列酮組(n=8，1mg/kg/d)、阿托伐他汀組(n=8，5mg/kg/d)和羅格列酮聯(lián)合阿托伐他汀組(n

11、=8，1mg/kg/d羅格列酮和5mg/kg/d阿托伐他汀)。除了正常組均于高脂飲食2周后行頸動脈球囊損傷術(同第三部分實驗)，術后繼續(xù)高脂飲食；正常組僅切開頸部皮膚，給予正常飼料，均共4周。術后4周末用流式細胞儀測量外周血中CD34和KDR雙陽性的細胞為循環(huán)EPCs。生化法檢測TC、TG、LDL-C、HDL-C和空腹血糖(Glu)。Griess法測定NO濃度，比色法測定血管壁O2-。行伊文氏藍染色，計算內皮再生面積與損傷總面積比(An

12、/At)評價再內皮化率；行蘇木素-伊紅染色，計算內膜與中膜比值(I/M)；免疫組化檢測血管壁α-SMA表達。掃描電鏡觀察血管壁的內皮修復情況。RT-PCR法檢測血管壁eNOS和NADPH氧化酶p22phox的mRNA表達。 結果： 1.羅格列酮組服藥后TC、LDL、TG、HDL和Glu不受影響。阿托伐他汀組的TC和LDL較損傷未干預組明顯下降(P＜0.05)，但TG、HDL和Glu無明顯改變(P＞0.05)。羅格列酮聯(lián)合

13、阿托伐他汀組TC和LDL較損傷未干預組和羅格列酮組顯著降低(P＜0.05)，但降低水平與阿托伐他汀組無差別(P＞0.05)，其對TG、HDL和血糖也無影響。 2.損傷未干預組的EPCs數(shù)量較正常組降低了40％；羅格列酮組和阿托伐他汀組均使EPCs數(shù)量升高，分別增加了57％和65％，且與正常組無差異(P＞0.05)；藥物聯(lián)合組則使EPCs數(shù)量進一步提高，增加了1倍(P＜0.05)。 3.正常組內皮細胞完整覆蓋內膜，沿著血流

14、方向排列；損傷未干預組內皮細胞大片剝脫；羅格列酮組和阿托伐他汀組仍有少許內皮剝脫，但較損傷未干預組少；羅格列酮聯(lián)合阿托伐他汀組則內皮覆蓋完全，但內皮細胞排列較正常組紊亂。 4.與正常組相比，損傷未干預組I/M顯著增高(0.28±0.03vs1.80±0.16，P＜0.05)，提示內膜增生形成；與損傷未干預組比較，羅格列酮組I/M顯著降低(1.80±0.16vs0.57±0.03，P＜0.05)；阿托伐他汀組也使I/M降低(1.8

15、0±0.16vs0.51±0.06，P＜0.05)；而聯(lián)合藥物治療后，使I/M降至正常水平(0.28±0.03vs0.37±0.06，P＞0.05)。 5.與正常組相比，未損傷干預組α-SMA表達顯著增加；羅格列酮組和阿托伐他汀組均分別使α-SMA表達下降，而藥物聯(lián)合干預組則使α-SMA進一步下降。 6.損傷未干預組較正常組血清NO水平降低83％(P＜0.05)，羅格列酮組和阿托伐他汀組NO水平分別較損傷未干預組升高了3

16、0％和38％，羅格列酮聯(lián)合阿托伐他汀組使NO進一步升高了62％，但仍低于正常組水平(P＜0.05)。損傷未干預組抗超氧陰離子(O2-)能力較正常組下降了約1.7倍；羅格列酮使其抗O2-能力提高了1倍(P＜0.05)；阿托伐他汀組則提高了87％(P＜0.05)；兩藥聯(lián)合提高了1.5倍(P＜0.05)，且與正常組無差別。 7.損傷未干預組eNOS的mRNA表達較正常組明顯降低(P＜0.05)；羅格列酮組和阿托伐他汀組均分別使損傷未干

17、預組eNOS的mRNA表達上調(P＜0.05)；藥物聯(lián)合治療后，eNOS的mRNA表達進一步升高，但未回復正常。相反，NADPHp22phoxmRNA在損傷未干預組呈明顯高表達，較正常組升高了1倍(P＜0.05)，羅格列酮組和阿托伐他汀組均使損傷未干預組表達下降(P＜0.05)。羅格列酮聯(lián)合阿托伐他汀組也使損傷未干預組NADPHp22phoxmRNA表達顯著降低，且降至正常水平。 結論： 羅格列酮在體內動員EPCs，是不