干預Notch信號通路治療大鼠肝纖維化.pdf

1、研究背景：
　　肝纖維化是機體對急性或者慢性肝臟損傷而產生的損傷-修復過程,以大量的細胞外基質沉積于肝臟為主要表現。肝星狀細胞的活化與增殖被認為是這一病變的關鍵環(huán)節(jié)?；罨母涡菭罴毎脑鲋澈头置诩毎饣|能力大大增加,且收縮和遷移能力增強。因此大部分的抗肝纖維化的研究是針對肝星狀細胞而展開。
　　Notch信號通路在細胞增殖、分化和正常胚胎發(fā)育中的作用是必不可少的。Notch在哺乳動物中的配體受體分子逐漸被發(fā)現。Notch信

2、號通路通過受體與鄰近細胞配體結合以后,受體胞內側被γ-分泌酶水解為胞內段(NICD)后轉入核內最終同核內目的基因結合而啟動信號轉錄。越來越多的研究表明Notch信號通路參與纖維化疾病,然而其在肝纖維化的具體作用機制尚未被完全地闡明。
　　上皮間質轉化(EMT)是一種上皮細胞逐漸失去上皮的表型特征而分化為具有間質細胞特性的現象。大量的研究已經表明EMT在器官纖維化發(fā)生中起到重要的作用。TGF-β1被認為是導致EMT最強的細胞因子。N

3、otch信號被證明與EMT有關。目前認為肝臟分泌細胞外基質的肌成纖維細胞可以由多種細胞經EMT發(fā)展而來。因此本實驗假設Notch信號通路參與肝纖維化的發(fā)生而展開研究。
　　目的：
　　通過干擾Notch信號通路影響HSC的活化;構建rAAV2/1-Jaggedl-shRNA治療實驗性大鼠肝纖維化;應用γ-分泌酶抑制劑阻斷Notch信號通路進一步探討Notch信號通路與肝纖維化的關系。
　　方法：設計Tagman探針檢測

4、Notch信號在HSC-T6中的具體表達情況,同時應用TGF-β1刺激HSC-T6,觀察Notch信號的變化情況。分別轉染Jagged1siRNA入HSC-T6沉默Jagged1基因和轉染攜帶全長Jagged1基因的真核表達質粒pcDNA3.1-Jagged1入HSC-T6過表達Jagged1,PCR和Western-blot檢測Jagged1,α-SMA and collagenⅠ;另外應用TGF-β1預刺激HSC-T6,然后再沉默J

5、agged1,同樣的方法檢測相同指標。構建rAAV2/1-Jaggedl-shRNA靜脈注射入大鼠,激光共聚焦顯微鏡下觀察轉染效率;免疫熒光觀察Notch信號的變化,PCR和Western-blot檢測EMT相關蛋白的變化效果。DAPT腹腔注射大鼠肝纖維化模型,同樣的方法檢測Notch信號通路的變化,大鼠肝纖維化變化情況和EMT相關蛋白變化情況。
　　結果：Notch信號在HSC-T6中是激活的。TGF-β1能顯著增強HSC-T6

6、細胞Notch信號的表達。基因沉默Jagged1抑制HSC-T6的活化,而過表達Jagged1則促進HSC-T6的活化。rAAV2/1-Jaggedl-shRNA靜脈注射入動物體內,干預組較對照組肝纖維化程度明顯減輕,α-SMA表達明顯低于對照組,而且TGF-β1,snail等蛋白相應表達下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。DAPT腹腔注射大鼠肝纖維化模型后則得到了同樣的效果。
　　結論：肝纖維化的形成與Notch信號通路的激