干預(yù)Notch信號通路治療大鼠肝纖維化.pdf

1、研究背景：
　　肝纖維化是機(jī)體對急性或者慢性肝臟損傷而產(chǎn)生的損傷-修復(fù)過程,以大量的細(xì)胞外基質(zhì)沉積于肝臟為主要表現(xiàn)。肝星狀細(xì)胞的活化與增殖被認(rèn)為是這一病變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?；罨母涡菭罴?xì)胞的增殖和分泌細(xì)胞外基質(zhì)能力大大增加,且收縮和遷移能力增強(qiáng)。因此大部分的抗肝纖維化的研究是針對肝星狀細(xì)胞而展開。
　　Notch信號通路在細(xì)胞增殖、分化和正常胚胎發(fā)育中的作用是必不可少的。Notch在哺乳動物中的配體受體分子逐漸被發(fā)現(xiàn)。Notch信

2、號通路通過受體與鄰近細(xì)胞配體結(jié)合以后,受體胞內(nèi)側(cè)被γ-分泌酶水解為胞內(nèi)段(NICD)后轉(zhuǎn)入核內(nèi)最終同核內(nèi)目的基因結(jié)合而啟動信號轉(zhuǎn)錄。越來越多的研究表明Notch信號通路參與纖維化疾病,然而其在肝纖維化的具體作用機(jī)制尚未被完全地闡明。
　　上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是一種上皮細(xì)胞逐漸失去上皮的表型特征而分化為具有間質(zhì)細(xì)胞特性的現(xiàn)象。大量的研究已經(jīng)表明EMT在器官纖維化發(fā)生中起到重要的作用。TGF-β1被認(rèn)為是導(dǎo)致EMT最強(qiáng)的細(xì)胞因子。N

3、otch信號被證明與EMT有關(guān)。目前認(rèn)為肝臟分泌細(xì)胞外基質(zhì)的肌成纖維細(xì)胞可以由多種細(xì)胞經(jīng)EMT發(fā)展而來。因此本實驗假設(shè)Notch信號通路參與肝纖維化的發(fā)生而展開研究。
　　目的：
　　通過干擾Notch信號通路影響HSC的活化;構(gòu)建rAAV2/1-Jaggedl-shRNA治療實驗性大鼠肝纖維化;應(yīng)用γ-分泌酶抑制劑阻斷Notch信號通路進(jìn)一步探討Notch信號通路與肝纖維化的關(guān)系。
　　方法：設(shè)計Tagman探針檢測

4、Notch信號在HSC-T6中的具體表達(dá)情況,同時應(yīng)用TGF-β1刺激HSC-T6,觀察Notch信號的變化情況。分別轉(zhuǎn)染Jagged1siRNA入HSC-T6沉默Jagged1基因和轉(zhuǎn)染攜帶全長Jagged1基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Jagged1入HSC-T6過表達(dá)Jagged1,PCR和Western-blot檢測Jagged1,α-SMA and collagenⅠ;另外應(yīng)用TGF-β1預(yù)刺激HSC-T6,然后再沉默J

5、agged1,同樣的方法檢測相同指標(biāo)。構(gòu)建rAAV2/1-Jaggedl-shRNA靜脈注射入大鼠,激光共聚焦顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率;免疫熒光觀察Notch信號的變化,PCR和Western-blot檢測EMT相關(guān)蛋白的變化效果。DAPT腹腔注射大鼠肝纖維化模型,同樣的方法檢測Notch信號通路的變化,大鼠肝纖維化變化情況和EMT相關(guān)蛋白變化情況。
　　結(jié)果：Notch信號在HSC-T6中是激活的。TGF-β1能顯著增強(qiáng)HSC-T6

6、細(xì)胞Notch信號的表達(dá)。基因沉默Jagged1抑制HSC-T6的活化,而過表達(dá)Jagged1則促進(jìn)HSC-T6的活化。rAAV2/1-Jaggedl-shRNA靜脈注射入動物體內(nèi),干預(yù)組較對照組肝纖維化程度明顯減輕,α-SMA表達(dá)明顯低于對照組,而且TGF-β1,snail等蛋白相應(yīng)表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。DAPT腹腔注射大鼠肝纖維化模型后則得到了同樣的效果。
　　結(jié)論：肝纖維化的形成與Notch信號通路的激