Notch信號(hào)與BLM誘導(dǎo)大鼠肺纖維化.pdf

1、背景
　　肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（Pulmonarymicrovascularendothelialcells，PMVECs）是肺氣血屏障的重要組成結(jié)構(gòu)，生理情況下維持人體正常的呼吸交換功能，其功能變化對(duì)維持血管正常結(jié)構(gòu)以及肺組織損傷后的修復(fù)起重要作用。在肺纖維化（Pulmonaryfibrosis，PF）的形成過程中，成纖維細(xì)胞（Fibroblast，F(xiàn)b）的激活及轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞（Myofibroblast，MFb）是肺間質(zhì)內(nèi)基質(zhì)

2、成分過度沉積的關(guān)鍵因素。已經(jīng)證實(shí)，肺內(nèi)MFb有四種來源：間質(zhì)內(nèi)的Fb在炎細(xì)胞分泌細(xì)胞因子作用下轉(zhuǎn)化成MFb；骨髓干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為MFb；肺泡上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（Epithelial-mesenchymaltransition，EMT）；血管內(nèi)皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（Endothelial-mesenchymaltransition，EndoMT）。其中EndoMT在肺纖維化形成中的地位和作用已經(jīng)引起廣泛關(guān)注。
　　既往的研究中發(fā)現(xiàn)，PF

3、患者及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型肺組織血管密度分布不均，在纖維化區(qū)周邊存在異常的新生血管，而中心區(qū)血管退化[1]。增生的PMVECs分化不全，形成的微血管血液灌注不良，不能發(fā)揮正常的生理功能。我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，博萊霉素（Bleomycin，BLM）致PF大鼠PMVECs增殖活躍并分泌促纖維化的細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長因子-β1（Transforminggrowthfactor，TGF-β1）和結(jié)締組織生長因子（Connectivetissuegrowth

4、factor，CTGF），而且與PMVECs共培養(yǎng)的Fbs可顯著增加平滑肌肌動(dòng)蛋白（αsmoothmuscleactin，a-SMA）的表達(dá)[2]。目前，PMVECs的這種異常增殖、分泌致纖維化因子及EndoMT的調(diào)控因素不明。
　　Notch信號(hào)通路廣泛參與機(jī)體發(fā)育、細(xì)胞分化及穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)。近年來發(fā)現(xiàn)，Notch對(duì)EC的增殖和分化具有重要的調(diào)節(jié)作用。Notch激活可通過抑制血管內(nèi)皮生長因子受體2（Vascularendothelia

5、lgrowthfactorreceptor2，VEGFR2/Flk-1/KDR）的表達(dá)特異性調(diào)控由VEGF誘導(dǎo)的EC增殖與分化，使血管正常發(fā)育并維護(hù)其生理功能。
　　綜上所述，MFb是肺纖維化形成的標(biāo)志性細(xì)胞，而MFb的來源，包括PMVECs來源的EndoMT，具有多樣化的特點(diǎn)。基于Notch信號(hào)在調(diào)控增殖的微血管中的作用，我們假設(shè)BLM可能降低或損傷了多種細(xì)胞的Notch信號(hào)通路，致使其成為調(diào)控增殖狀態(tài)的PMVECs及Fbs轉(zhuǎn)化

6、為EndoMT及MFb的前提和基礎(chǔ)。
　　方法和目的
　　本實(shí)驗(yàn)采用氣管內(nèi)注入BLM誘導(dǎo)SD大鼠PF模型，氣管內(nèi)注入等體積生理鹽水作為對(duì)照。分別于給藥后第7天和第14天處死大鼠，取外周肺組織原代培養(yǎng)PMVECs和Fbs并鑒定，余肺組織常規(guī)固定、包埋、切片、VG染色。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺組織中Hes1、KDR的表達(dá)；細(xì)胞免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)PMVECs中PCNA的表達(dá)水平；蛋白印記（westernblot）、實(shí)時(shí)定量PCR（

7、Real-timePCR）檢測(cè)各組PMVECs中Notch信號(hào)通路重要分子Hes1、Notch1、Jag1、Dll4的蛋白及mRNA水平的表達(dá)；WesternBlot檢測(cè)Fbs中Notch信號(hào)相關(guān)分子的蛋白表達(dá)水平；結(jié)合各組PCNA和α-SMA的表達(dá)情況，以明確PF時(shí)Notch信號(hào)通路發(fā)生的變化，以及對(duì)PMVECs和Fbs增殖、分化的影響。
　　結(jié)果
　　1.細(xì)胞免疫熒光及WesternBlot檢測(cè)BLM組PMVECs的PC

8、NA蛋白表達(dá)上調(diào)且α-SMA表達(dá)增加，免疫組織熒光顯示BLM組肺內(nèi)有共表達(dá)α-SMA和VWF的細(xì)胞存在，證實(shí)BLM大鼠PMVECs不僅處于增殖狀態(tài)，而且表型已發(fā)生轉(zhuǎn)變。
　　2.免疫組織化學(xué)、WesternBlot、Real-timePCR檢測(cè)顯示BLM組PMVECs的Hes1表達(dá)下調(diào)，KDR表達(dá)上調(diào)，Jag1表達(dá)明顯上調(diào)，而Dll4表達(dá)較正常組低，提示肺纖維化時(shí)PMVECs的Notch信號(hào)通路抑制且配體表達(dá)異常。
　　3.

9、WesternBlot檢測(cè)顯示BLM組Fbs的Hes1表達(dá)下調(diào)，Jag1上調(diào)，同時(shí)PCNA及α-SMA的表達(dá)水平增高，提示肺纖維化時(shí)Notch信號(hào)的抑制可能與MFb的產(chǎn)生有關(guān)。
　　結(jié)論
　　1.PMVECs的EndoMT及Fbs向MFb轉(zhuǎn)分化可能是BLM大鼠肺纖維化形成的重要原因之一，而Notch信號(hào)通路抑制是BLM大鼠異常增殖的PMVECs及Fbs轉(zhuǎn)分化為EndoMT及MFb的基礎(chǔ)。
　　2.Notch配體Jag1