CBD-bFGF對(duì)BLM誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的生物學(xué)作用及相關(guān)機(jī)制.pdf

1、特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種慢性、進(jìn)行性加重的肺間質(zhì)疾病,發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。迄今IPF病因不明,缺乏有效治療手段,IPF確診后中位生存期不足3年,預(yù)后極差,是臨床研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。糖皮質(zhì)激素或聯(lián)合免疫抑制劑仍然是目前治療IPF的主要手段,但有效率低。近年來得益于分子生物科學(xué)的快速發(fā)展,通過細(xì)胞因子治療肺纖維化已得到證實(shí)。
　　堿性成纖維因子(Basic fibrobla

2、st growth factor,bFGF)是一種多功能損傷修復(fù)因子,但在肺纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中其生物學(xué)意義尚缺乏完整的研究報(bào)道。鑒于此,本實(shí)驗(yàn)將bFGF與膠原結(jié)合域(Collagen-bind domain,CBD)連接,重組后的CBD-bFGF干預(yù)小鼠肺纖維化各個(gè)階段,初步發(fā)現(xiàn)在小鼠早期肺纖維化給予CBD-bFGF無明顯的生物學(xué)作用,而在小鼠中晚期肺纖維化給予CBD-bFGF可促進(jìn)TGF-β1的表達(dá),并與TGF-β1協(xié)同,加重小鼠

3、肺纖維化。本實(shí)驗(yàn)為今后研究干擾bFGF的表達(dá),以治療肺纖維化的新策略提供了基礎(chǔ)。本文從以下幾部分進(jìn)行了論述。
　　第一部分:CBD-bFGF對(duì)BLM誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的早期干預(yù)作用及相關(guān)機(jī)制
　　目的:探索膠原結(jié)合域-成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(CBD-bFGF)對(duì)博萊霉素(Bleomycin,BLM)誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的早期干預(yù)作用及機(jī)制。
　　方法:將C57/BL雄性小鼠160只隨機(jī)分為3組:(1)Sham組40只;(2)BL

4、M組60只;(3)BLM+bFGF組60只。Sham組兩次氣管暴露注入0.1ml生理鹽水;BLM組氣管注入先博萊霉素溶液(3mg/kg),后立即氣管注入0.1ml生理鹽水;BLM+bFGF組先氣管注入博萊霉素溶液(3mg/kg),后立即氣管注入等體積CBD-bFGF溶液(0.1ml,20ug/ml)。分別于7d、14d、21d、28d觀察下列指標(biāo):(1)小鼠一般情況;(2)小鼠體重變化情況;(3)H&E、Masson染色檢測(cè)肺組織形態(tài)學(xué)

5、;(4)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺組織中的α-肌動(dòng)蛋白(α-smucle actin,α-SMA)、I型膠原蛋白(Collagen-Ⅰ、Col-Ⅰ)、Ⅲ型膠原蛋白(Collagen-Ⅲ, Col-Ⅲ)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)等蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)Sham組小鼠呼吸平穩(wěn),行動(dòng)自如,攝食、飲水正常;BLM組小鼠自3d起出現(xiàn)呼吸急促,行動(dòng)遲緩,食欲不振,肢端出現(xiàn)紫

6、紺等表現(xiàn);BLM+bFGF組一般情況與BLM組相似。(2)Sham組小鼠體重持續(xù)增加;BLM組體重持續(xù)下降,21d后輕度上升,與Sham組比較各觀察點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.01), BLM+bFGF組體重逐漸下降,各時(shí)間點(diǎn)與BLM組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。(3)Sham組光鏡下未見明顯異常病理改變;BLM組光鏡下肺組織大量纖維細(xì)胞增殖,細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積,部分肺組織結(jié)構(gòu)破壞,可見肺泡腔塌陷或消失,肺纖維化形成,Ashc

7、roft評(píng)分與Sham組比較有顯著差異(p<0.01);BLM+bFGF組光鏡下小鼠肺纖維化形成,與BLM組比較Ashcroft評(píng)分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。(4)各組肺組織可見α-SMA、Collagen-I、Collagen-Ⅲ蛋白的表達(dá),BLM+bFGF組、BLM組分別與sham組比較均有顯著性增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01,p<0.01),但BLM+bFGF組與BLM組之間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。在7d

8、、14d觀察點(diǎn),BLM+bFGF組、BLM組TGF-β1表達(dá)較sham組顯著增多(p<0.01,p<0.01),21d、28d觀察點(diǎn)BLM+bFGF組、BLM組TGF-β1表達(dá)下降,與sham組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05,p<0.05), BLM+bFGF組,與BLM組相比各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。
　　結(jié)論:(1)博萊霉素能成功誘導(dǎo)小鼠肺纖維化;(2)早期給予CBD-bFGF對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維

9、化無顯著的生物學(xué)作用。
　　第二部分:CBD-bFGF對(duì)BLM誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的中晚期干預(yù)作及相關(guān)機(jī)制
　　目的:探索膠原結(jié)合域-成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(CBD-bFGF)對(duì)博萊霉素(Bleomycin,BLM)誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的中晚期干預(yù)作用及機(jī)制。
　　方法:按照第一部分方法復(fù)制140只小鼠肺纖維化模型后,正常飼養(yǎng)6w。造模存活小鼠隨機(jī)分為2組:(1)BLM組40只;(2)BLM+bFGF組40只。BLM組氣管注入0.

10、1ml生理鹽水,BLM+bFGF組氣管注入同體積CBD-bFGF(2ug/只)。按照第一部分方法設(shè)置Sham組。分別于18w、22w、26w.觀察下列指標(biāo):(1)小鼠體重變化；(2)H&E、Masson染色檢測(cè)肺組織形態(tài)學(xué);(3)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺組織中α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TGF-β1等蛋白表達(dá);(4)小鼠肺功能和血?dú)夥治觥?br>　　結(jié)果:(1)Sham對(duì)照組在氣管暴露給予生理鹽水后體重輕度下降,后體重持續(xù)增加;BL

11、M組:0-10w體重持續(xù)下降,26w體重輕度恢復(fù),各時(shí)間點(diǎn)與Sham組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);BLM+bFGF組:體重持續(xù)降低,14w后各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)體重均低于BLM組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。(2)Sham組光鏡下肺組織正常;BLM組18w、22w、26w肺組織膠原纖維及成纖維細(xì)胞廣泛增生,肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞,部分肺泡腔萎陷、消失;BLM+bFGF組肺纖維化程度較BLM組加重,18w觀察點(diǎn)Ashcroft評(píng)分差異有

12、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),22w、26w觀察點(diǎn)有顯著性差異(p<0.01)。(3)BLM+bFGF組肺組織α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ等蛋白表達(dá)較BLM組增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01,p<0.05,p<0.05)。在26w觀察點(diǎn),BLM+bFGF組TGF-β1表達(dá)較BLM組增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。(4)與Sham組相比,BLM組與BLM+bFGF組肺順應(yīng)性下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。BLM+b