氧化苦參堿抑制博來霉素致小鼠肺纖維化形成及相關機制的實驗研究.pdf

1、肺纖維化(Pulmonary fibrosis，PF)是由于多種原因導致的肺臟損傷，是一種進行性、破壞性疾病。病因包括毒物、自身免疫、藥物、感染以及創(chuàng)傷等。PF的病理特點表現(xiàn)為片狀慢性間質性炎癥、過多的細胞外基質沉積、成纖維細胞增殖以及肺泡結構改變，導致進行性纖維化及肺功能喪失[1-3]。迄今為止，盡管已有多方面的實驗及臨床研究，但PF的發(fā)病率和死亡率依然呈增長趨勢，而且平均存活期從確診至死亡不超過3年[4，5]。PF的傳統(tǒng)的治療策略包

2、括糖皮質激素或聯(lián)合免疫抑制劑，然而這些藥物的療效正受到質疑，而且長期應用糖皮質激素通常會產(chǎn)生一些副作用，如免疫妥協(xié)、胃潰瘍、高血壓、骨質疏松、內分泌和代謝異常[1，6]。因此，迫切需要開發(fā)有效的、可以信賴的藥物治療PF。
　　 氧化苦參堿(Oxymatrine，OM)，是從傳統(tǒng)中藥苦參中分離出來的生物堿?？鄥⒁呀?jīng)被中國食品藥品監(jiān)督管理局批準用于乙肝治療[7，8]。累積證據(jù)表明，OM具有多種生物和藥理學特性，例如抗炎[9-11]、

3、抗腫瘤[12，13]、抗凋亡[14]、抗纖維化[15]、抗氧化[16]及抗心律失常作用[17]。陳等[18]研究證實OM能夠減輕博來霉素(bleomycin，BLM)誘導的小鼠肺纖維化，這種作用與抑制BLM誘導的肺炎癥、脂質過氧化、成纖維細胞增殖和膠原合成相關。然而，OM對PF的抗纖維化作用的確切機制仍未被完全闡明。
　　 一氧化氮(Nitric oxide，NO)是一種內源性短時存在的自由基，在許多肺疾病中發(fā)揮重要作用，包括P

4、F[19,20]。目前有三種一氧化氮合成酶(NO synthase，NOS)，即神經(jīng)型(nNOS)、內皮型(eNOS)、誘導型(iNOS)[21]。以前的動物模型和人類的PF研究中證實存在iNOS誘導的NO產(chǎn)生增加[22-24]。在PF中，轉化生長因子β1(Transforming growthfactor-β1，TGF-β1)是公認的關鍵性致纖維生成細胞因子，可以導致膠原在肺部的過度生成和沉積[25]。在PF患者和動物模型的肺組織中已

5、經(jīng)發(fā)現(xiàn)TGF-β1的過高表達[26]。
　　 根據(jù)上述的研究基礎，我們假想在BLM誘導PF中，OM可通過抑制iNOS表達和TGF-β/smad信號途徑發(fā)揮抗纖維化作用。
　　 本實驗目的:通過建立博來霉素誘導的小鼠肺纖維化模型，觀察OM對小鼠肺纖維化抑制作用，并且進一步探討其抗纖維化作用潛在的機制。
　　 材料與方法：
　　 50只C57BL/6鼠被隨機分為5組:(1)對照組:氣管滴注生理鹽水;(2)模型

6、組:氣管滴注博來霉素誘導肺纖維化組(3.0mg/kg);(3)-(5)氧化苦參堿低、中、高劑量組:在滴注博來霉素一天后每天分別通過腹腔注射10，20，40mg/kg的氧化苦參堿進行治療，連續(xù)注射21天。在博來霉素滴注后的第15天和22天分別收集支氣管肺泡灌洗液和肺組織。HE染色法觀測肺組織形態(tài)學改變。利用試劑盒檢測肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和NO的水平，以及肺組織勻漿中MPO的活性和MDA含量。通過免疫組化、RT-PCR、west

7、em blot檢測肺組織中iNOS的表達。此外，通過western blot檢測肺組織中TGF-β1，Smad3，p-Smad3，Smad2,p-Smad2表達水平。
　　 結果：
　　 一、在博來霉素誘導鼠肺纖維化模型中，氧化苦參堿可以減輕肺組織病理改變
　　 經(jīng)氧化苦參堿治療21天之后通過HE染色來評價肺部組織病理學改變。在普通光學顯微鏡下，陰性對照組的肺組織形態(tài)學顯示為正常的肺泡腔和正常肺泡間隔。僅用博來霉

8、素處理的小鼠肺組織顯示明顯組織病理學異常，表現(xiàn)為肺泡結構混亂、廣泛的間隔增厚以及伴隨淋巴細胞、中性粒細胞、成纖維細胞的密集間質浸潤。與之形成對照，低中高劑量氧化苦參堿組分別顯示出炎癥細胞浸潤以及間質增厚有適度的改善。
　　 二、在博來霉素誘導鼠肺纖維化模型中，氧化苦參堿可以降低肺組織中MPO活性
　　 MPO活性是中性粒細胞流入組織的一個標志，利用試劑盒對之進行檢測。與陰性對照組相比，BLM滴注導致了MPO活性的急劇升高

9、，從2.81±0.24升到8.23±0.35 U/g蛋白(P＜0.01，n=5)。然而，OM(10，20，40 mg/kg)治療后，顯著減低了MPO活性，分別從8.23±0.35到6.37±0.55(P＜0.01，n=5)，從8.23±0.35到6.07±0.47(P＜0.01, n=5)，從8.23±0.35到4.49±0.42(P＜0.01, n=5)。OM呈劑量依賴性抑制MPO活性。
　　 三、在博來霉素誘導鼠肺纖維化模型

10、中，氧化苦參堿可以降低肺泡灌洗液中TNF-α和I L-6濃度
　　 BALF中TNF-a和IL-6代表促炎癥反應介質，它們被認為在PF發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。利用ELISA方法進行檢測，我們發(fā)現(xiàn)TNF-α和IL-6在陰性組最低限度表達。在BLM滴注2周之后，在BALF中觀察到TNF-α和IL-6水平明顯增加。然而，這些水平在OM應用后呈劑量依賴性下降，(P＜0.01，n=5)。
　　 四、在博來霉素誘導鼠肺纖維化模型中，

11、氧化苦參堿可以抑制TGF-β/smad信號轉導
　　 為了研究在BLM誘導的PF中，OM是否通過抑制TGF-β/Smad信號通路發(fā)揮抗纖維化作用，我們首先應用westemblot檢測了肺組織中TGF-β1的蛋白表達，BLM的滴注可以明顯增加肺組織中TGF-β1的蛋白表達，經(jīng)過OM治療可以呈劑量依賴性下調TGF-β1的蛋白表達。通過TGF-β1受體Ⅰ活化引起Smad信號磷酸化是TGF-β信號轉導的始發(fā)的關鍵步驟，我們應用weste

12、mblot檢測了BLM處理鼠肺中p-Smad2、p-Smad3。BLM組與陰性對照比，Smad2、Smad3磷酸化增加，OM治療以劑量依賴性方式抑制BLM活化的信號分子。
　　 五、在博來霉素誘導鼠肺纖維化模型中，氧化苦參堿可以降低肺組織中MDA水平
　　 MDA做為脂質過氧化一個指標，在BLM滴注的第22天，利用試劑盒進行檢測。陰性組為2.66±0.35 nmol/mg蛋白，BLM組為19.2±1.39 nmol/mg

13、蛋白，顯著升高(P＜0.01，n=5)。在OM(10，20，40 mg/kg)處理后，BLM誘導的脂質過氧化作用明顯下降，分別為12.78±0.79(P＜0.01，n=5)，9.06±0.79(P＜0.01，n=5)，4.71±0.45 nmol/mg蛋白(P＜0.01，n=5)，分別與BLM組比較有統(tǒng)計學差異。OM降低MDA水平呈劑量依賴性。
　　 六、在博來霉素誘導鼠肺纖維化模型中，氧化苦參堿通過抑制iNOS表達減少NO合成

14、發(fā)揮抗纖維化作用
　　 （一）氧化苦參堿可以降低肺泡灌洗液中NO的濃度
　　 來自于iNOS的NO是一種與組織損傷相關的毒性分子。我們檢測了BLM處理鼠BALF中NO含量。與陰性對照相比，BLM誘導PF模型組NO水平增加。OM治療顯著抑制BLM誘導BALF中NO水平上升(P＜0.01，n=5)。這種抑制作用呈劑量依賴性。
　　 （二）氧化苦參堿可以抑制肺組織中iNOS表達
　　 首先應用免疫組化方法檢測肺

15、組織中iNOS表達。陰性組，在少量的肺泡巨噬細胞可以微弱的發(fā)現(xiàn)iNOS陽性信號。在BLM滴注22天后，在肺泡上皮細胞、肺泡巨噬細胞和微血管內皮細胞可明顯地觀察到iNOS陽性信號。而OM在20和40 mg/kg劑量顯著減弱BLM誘導的肺組織中iNOS表達的上升，而在10 mg/kg劑量幾乎沒有看到iNOS表達下降。
　　 為了進一步確定在BLM誘導鼠PF中iNOS表達，分別應用RT-PCR和westernblot分析檢測iNOS

16、mRNA和蛋白水平。與陰性對照比較，在BLM組，iNOS mRNA水平明顯增加。OM應用呈劑量依賴性減弱BLM誘導PF中鼠肺組織的iNOSmRNA(P＜0.01，n=5)。與此同時，westemblot分析觀察到的變化與RT-PCR相一致。
　　 結論：
　　 在BLM誘導小鼠肺纖維化模型中
　　 一、氧化苦參堿可以減輕小鼠肺組織病理改變。
　　 二、氧化苦參堿通過抑制肺組織MPO活性及肺泡灌洗液中TNF