芪丹顆粒劑對博來霉素致大鼠肺纖維化微血管增生的實驗研究.pdf

1、肺纖維化是多種原因引起的慢性肺疾病的共同結(jié)局，是呼吸衰竭的主要病理基礎(chǔ)，其病理特點是肺部炎癥導(dǎo)致肺泡持續(xù)性損傷及細胞外基質(zhì)的反復(fù)破壞、修復(fù)、重建和過度沉積，是呼吸內(nèi)科四大病譜(感染性肺疾病、阻塞性肺疾病、腫瘤性肺疾病、間質(zhì)性肺疾病)之一。目前尚無有效治療，臨床上多用糖皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑為主，易產(chǎn)生較嚴重的藥物副作用。確診后五年生存率低于50﹪。肺纖維化發(fā)病機制比較復(fù)雜，至今尚未完全闡明。既往認為慢性炎癥在肺纖維化的發(fā)病機制中占主導(dǎo)

2、地位，但基于此理論的抗炎、免疫抑制治療并不理想。近年來，細胞因子的研究取得了重大進步，明確了許多細胞因子在肺纖維化發(fā)生、發(fā)展中的作用，但并不能完全解釋肺纖維化發(fā)病中的所有現(xiàn)象?，F(xiàn)階段，微血管醫(yī)學(xué)作為一門新興學(xué)科，越來越受到人們的重視。微血管的損傷、新生及調(diào)控障礙在纖維化病灶中的地位得到認可。肺組織廣泛肺損傷后可能有利于血管新生重構(gòu)的組織微環(huán)境存在，持續(xù)存在的促進血管新生微環(huán)境導(dǎo)致血管增生過度，而炎性細胞活化、成纖維細胞增生、合成大量膠原

3、纖維和細胞外基質(zhì)的沉積均依賴于血管生成提供必需的營養(yǎng)。改善微循環(huán)，活血化瘀，控制損傷后修復(fù)在正常范圍內(nèi)，防止膠原的過度形成，可能是治療纖維化的一個嶄新途徑。 芪丹顆粒劑是中藥的復(fù)合制劑，具有益氣活血化瘀，改善微循環(huán)的功能，并在長期的臨床應(yīng)用中取得了滿意的療效。本課題選用氫化可的松為對照組，通過VG染色和肺組織羥脯氨酸含量測定來觀察芪丹顆粒劑對博來霉素致肺纖維化大鼠膠原含量的影響，采用免疫組化法(Ⅷ因子)計數(shù)微血管，測定微血管密度

4、(MVD)，用免疫組織化學(xué)法檢測肺組織中血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)及缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)的蛋白表達情況，探討微血管增生在纖維化形成中的作用，觀察VEGF和HIF-1α在微血管形成中的改變，以及VEGF與HIF-1α和MVD之間的相互關(guān)系，尋找微血管形成的始動因素，探討芪丹顆粒劑治療肺纖維化的作用機理。 目的： 1、采用VG染色法，以及肺組織勻漿羥脯氨酸定量法，觀察芪丹顆粒劑對博來霉素致大鼠肺纖維化膠原

5、代謝的影響，并與氫化可的松相比較，觀察芪丹顆粒劑對肺纖維化的干預(yù)作用。 2、采用Ⅷ因子抗體免疫組化標(biāo)記肺血管，顯微鏡下計算微血管，測定微血管密度(MVD)，免疫組化法測定VEGF與HIF-1α的蛋白表達，探討微血管增生在肺纖維化中的作用。用LeicaQwinV3分析軟件對VEGF與HIF-1α蛋白表達量行灰度值測定，用SPSS11.5軟件對VEGF與HIF-1α、MVD之間的相關(guān)性進行分析。尋找微血管形成的始動因素，探討芪丹顆粒

6、劑治療肺纖維化的作用機理。 方法： 1、160只健康雄性清潔級大鼠，隨機區(qū)組分為健康對照組(N)，博來霉素模型組(B)，氫化考的松組(H1、H2)，芪丹顆粒劑組(Q1，Q2)。用2﹪戊巴比妥鈉(0.2ml/100g)腹腔內(nèi)注射麻醉，在額鏡注視下將硬脊膜麻醉導(dǎo)管插入氣管，緩慢注入0.4﹪博來霉素0.25ml(5mg/Kg，4mg/ml)，注藥后立即將動物直立旋轉(zhuǎn)，使藥物在肺內(nèi)分布均勻，制成肺間質(zhì)纖維化模型。造模次日開始，N

7、組、Q1組、H1組每日分別給予生理鹽水灌胃(2ml/只)、芪丹顆粒劑(3125mg/kg，用生理鹽水溶解，每只大鼠1.2-2.5ml)灌胃，氫化可的松瑚珀酸鈉(25mg/kg)腹腔注射；Q2組、H2組于造模第15日開始分別給于芪丹顆粒劑灌胃和氫化考的松腹腔注射(劑量同1組)。6組動物均在第7天、14天、28天、42天隨機處死5只(N組)和10只(B組、M組、Q組)。具體分組、處死情況見表1。取大鼠右肺中葉，10﹪福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟

8、包埋。用蘇木素-伊紅(HE)評價肺組織病理學(xué)變化。 2、VG染色觀察肺組織中膠原含量、分布和形態(tài)學(xué)變化，肺組織勻漿羥脯氨酸定量法測定肺組織中膠原含量。 3、采用Ⅷ因子抗體免疫組化標(biāo)記肺血管，顯微鏡下計算微血管，測定微血管密度(MVD)。 4、觀測纖維化大鼠肺組織中血管內(nèi)皮細胞生長因子、缺氧誘導(dǎo)因子-1α蛋白表達的動態(tài)改變。 5、用LeicaQwinV3分析軟件測定血管內(nèi)皮細胞生長因子與缺氧誘導(dǎo)因子-1α表

9、達的灰度值，用SPSS11.5軟件對血管內(nèi)皮細胞生長因子與微血管密度之間的相關(guān)性進行分析。 結(jié)果： 1、博來霉素致大鼠肺纖維化肺組織病理顯示：芪丹顆粒劑組肺胞炎及肺纖維化程度均明顯低于模型組和氫可組(P＜0.05)。 2、觀察VG染色、測定肺組織勻漿中羥脯氨酸含量，觀察肺組織膠原含量的變化。結(jié)果顯示：芪丹顆粒劑組膠原含量低于氫化可的松組(P＜0.01)。 3、大鼠肺組織Ⅷ因子相關(guān)抗原染色測定微血管密度：博

10、來霉素致傷大鼠后，肺組織中新生血管增多，14天時達高峰，此后隨著膠原纖維沉積，肺組織正常結(jié)構(gòu)基本消失，被膠原纖維沉積，少見血管。模型組血管增多明顯，小血管形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂，多有不同程度的擴張。14天組芪丹組與模型組比較，MVD明顯減輕(P＜0.05)，芪丹組與氫可組比較有非常顯著性差異(P＜0.05)。 4、免疫組織化學(xué)染色(S-P法)觀察到VEGF蛋白陽性表達為棕黃色顆粒，主要位于細胞胞漿，胞膜也有表達。在肺泡Ⅱ型上皮細胞

11、(ATEⅡ)、支氣管上皮細胞、血管周圍平滑肌細胞、肺胞巨噬細胞，和少量的肺內(nèi)間質(zhì)細胞內(nèi)也可見VEGF蛋白表達。正常對照組無明顯陽性表達。各實驗組7天時VEGF蛋白陽性表達增高，14天時達到高峰，28天后VEGF表達明顯減少。14天時芪丹組與模型組、氫考組比較有非常顯著性差異，P＜0.01。28天時芪丹組與模型組、氫考組比較有顯著性差異，P＜0.05。 5、HIF-1α在大鼠肺組織中的表達，7天時各組之間HIF-1α陽性信號表達無

12、明顯差異。14天時芪丹組HIF-1α陽性信號輕度表達，芪丹組與模型組、氫考組之間有顯著性差異，P＜0.05。28天時芪丹組與氫考組比較，有顯著性差異P＜0.05。42天時表達降低接近正常，各組之間無明顯差異。 6、LeicaQwinV3分析軟件對纖維化大鼠肺組織中VEGF與MVD、HIF-1α蛋白表達相關(guān)性分析顯示：纖維化大鼠肺組織中HIF-1α與VEGF蛋白表達之間存在一致性，VEGF與MVD兩者表達有顯著性正相關(guān)，14天、2

13、8天時芪丹組與模型組、氫可組之間有非常顯著的相關(guān)性。 結(jié)論： 1、VG染色和肺組織均漿羥脯氨酸測定顯示：芪丹顆粒劑、氫化可的松均可減輕博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺組織膠原沉積，并且有逆轉(zhuǎn)纖維化的作用。芪丹顆粒劑作用優(yōu)于氫化可的松。 2、大鼠肺組織中微血管密度與博來霉素致大鼠肺纖維化密切相關(guān)，血管內(nèi)皮細胞生長因子、缺氧誘導(dǎo)因子-1α的高表達與血管內(nèi)皮損傷相一致，可能是博來霉素誘發(fā)大鼠肺纖維化的重要啟動因子之一。 3