IL-33在肺纖維化形成中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:觀察rhIL-33（重組人白細(xì)胞介素-33）對(duì)上皮來源的A549細(xì)胞和HELF（人胚肺成纖維細(xì)胞）增殖及相關(guān)細(xì)胞標(biāo)記物的影響，探討IL-33/ST2L-TRAF-6信號(hào)通路在肺纖維化發(fā)病過程中的作用及其機(jī)制。
　　 方法:分別培養(yǎng)A549細(xì)胞和HELF，用RT-PCR法檢測IL-33受體ST2LmRNA的表達(dá);以不同濃度IL-33分別刺激上述兩種細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)以MTT方法檢測不同濃度IL-33對(duì)A549細(xì)胞和HELF增

2、殖的影響（①若對(duì)增殖有影響則選擇出最佳刺激濃度;②若無影響則以Westernblot法檢測不同濃度IL-33對(duì)細(xì)胞標(biāo)記物的影響，從而選擇出于預(yù)濃度）;以Real-timePCR法檢測IL-33刺激細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)兩種細(xì)胞標(biāo)志性基因E-cadmRNA、α-SMAmRNA、VimentinmRNA和collagenⅠmRNA等的變化以及IL-33/ST2L信號(hào)通路中關(guān)鍵因子TRAF-6mRNA的表達(dá)改變;用Westernblotting法檢

3、測細(xì)胞標(biāo)志性蛋白E-cad（E-鈣黏連蛋白）、α-SMA（α-平滑肌肌動(dòng)蛋白）、collagenⅠ（Ⅰ型膠原）、Vimentin（波形蛋白）以及關(guān)鍵性信號(hào)分子TRAF-6（腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6）的改變。
　　 結(jié)果:(1)在A549細(xì)胞與HELF中均能成功檢測到ST2L基因的表達(dá)。
　　 (2)MTT結(jié)果顯示各組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，隨時(shí)間延長，細(xì)胞數(shù)量不斷增多。加入不同濃度IL-33刺激細(xì)胞培養(yǎng)24h、48h、72

4、h后，A549細(xì)胞增殖與control組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。而HELF在10ng/mlIL-33的刺激下細(xì)胞增值率顯著提高，在72h時(shí)作用最為明顯(P＜0.05)。因此，采用10ng/mlIL-33作為刺激濃度。
　　 (3)在不同濃度IL-33(5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml)刺激下，A549細(xì)胞與control相比，E-cad蛋白表達(dá)量在10ng/ml處最低(P＜0.05)，α-SMA的表達(dá)呈逐漸

5、上調(diào)的趨勢(P＜0.05)。綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，A549細(xì)胞亦選用10ng/ml的IL-33刺激細(xì)胞進(jìn)行下一步研究。
　　 (4)Real-timePCR顯示IL-33刺激A549細(xì)胞后，在0h～72h之間，E-cad基因表達(dá)為先下調(diào)后上調(diào)的趨勢(P＜0.05)，72h仍低于control組(P＜0.05);α-SMA、Vimentin及TRAF-6基因表達(dá)在0h～72h之間呈先上升后下降的趨勢，72h時(shí)Vimentin和TRAF

6、-6基因均高于control組(P＜0.05)，α-SMA表達(dá)在72h時(shí)亦高于control組，但統(tǒng)計(jì)學(xué)意義不明顯(P＞0.05)。IL-33刺激HELF后，在0～72hα-SMA、Vimentin、CollagenⅠ及TRAF-6等基因的表達(dá)均呈先升高后降低的趨勢(P＜0.05)，12h各基因表達(dá)量與control相比升高程度最明顯(P＜0.05)，隨后呈下調(diào)趨勢，但72h時(shí)表達(dá)水平仍高于對(duì)照組。
　　 (5)Westernb

7、lot顯示A549細(xì)胞在0～72h時(shí)，E-cad蛋白表達(dá)呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的趨勢，72h表達(dá)量仍低于control組(P＜0.05);Vimentin、CollagenⅠ及TRAF-6蛋白等在0h～72h呈先升高后下降趨勢，72hCollagenⅠ、Vimentin蛋白表達(dá)均高于control組(P＜0.05)，TRAF-6蛋白表達(dá)在72h表達(dá)量雖高于control組，但兩組差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義不明顯(P＞0.05)。
　　 用IL-

8、33刺激HELF后，α-SMA、Vimentin、CollagenⅠ蛋白的表達(dá)量及信號(hào)分子TRAF-6在0～72h內(nèi)的表達(dá)均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，TRAF-6在72h與對(duì)照組相比仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其余蛋白在72h與對(duì)照組相比統(tǒng)計(jì)學(xué)意義不明顯(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:(1)用IL-33刺激兩種細(xì)胞后，上皮細(xì)胞標(biāo)志物呈先下調(diào)后上調(diào)的趨勢，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物隨著時(shí)間的延長均呈現(xiàn)先升高后降低的變化。推測在肺纖維化進(jìn)程

9、中，IL-33促使上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(即EMT)，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并且這兩種變化在細(xì)胞受損早期修復(fù)及炎癥反應(yīng)過程中最為明顯。
　　 (2)TRAF-6表達(dá)量隨IL-33作用時(shí)間的延長先升高后降低，表明在IL-33誘導(dǎo)肺纖維化過程中，IL-33/ST2L-TRAF-6信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)被激活。隨著時(shí)間的延長，IL-33的作用逐漸減弱，推測分泌型受體sST2可能抑制了此通路的效應(yīng)，IL-33/ST2L-TRAF-6