IL-33在HIV感染疾病進(jìn)展中的作用及機制研究.pdf

1、目的：艾滋病即獲得性免疫缺陷綜合癥(Acquired Immune DeficiencySyndrome，AIDS)，是由人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)引起的一種嚴(yán)重傳染病。大部分HIV感染者感染8-10年后進(jìn)入艾滋病期，但部分患者在感染HIV后短時間內(nèi)CD4+T細(xì)胞計數(shù)快速下降到350 cells/μL以下，引起這種CD4+T細(xì)胞快速下降的原因還不是很明確。大量數(shù)據(jù)表明，HIV不同

2、疾病進(jìn)展與感染病毒的類型、免疫應(yīng)答狀況、病毒與宿主相互作用中的免疫逃逸、宿主遺傳背景以及環(huán)境物理和生物因子等有關(guān)。白細(xì)胞介素1(Interleukin1，IL-1)是最早被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子之一，在細(xì)胞間相互作用、免疫調(diào)節(jié)及炎癥反應(yīng)中起重要作用，其中IL-1家族中針對IL-1β、IL-1Ra及IL-18的中和活性單克隆抗體或重組蛋白已被批準(zhǔn)成功應(yīng)用于多種臨床疾病的治療。白細(xì)胞介素33(Interleukin33，IL-33)是白介素家族的最

3、新成員，最初作為一種新型“警報素”被研究。警報素是指病原生物感染及創(chuàng)傷等因素導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡時釋放或分泌的一類宿主蛋白，可以募集和激活抗原提呈細(xì)胞，啟動固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。IL-33在內(nèi)皮和上皮細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，當(dāng)創(chuàng)傷和感染引起內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞損傷時，壞死細(xì)胞釋放的IL-33可以作為警報素，募集和活化具有相應(yīng)受體的固有免疫細(xì)胞，如樹突狀細(xì)胞(DC)、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK)和自然殺傷T細(xì)胞(NKT)細(xì)胞等

4、，使其釋放促炎性細(xì)胞因子、趨化因子、組胺和前列腺素等炎性介質(zhì)，引發(fā)和促進(jìn)炎癥反應(yīng)，增強吞噬細(xì)胞和殺傷細(xì)胞功能。近期多項研究顯示，IL-33不僅發(fā)揮警報素作用，還可調(diào)控免疫應(yīng)答過程，在機體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。動物實驗顯示IL-33可以驅(qū)動殺傷性T細(xì)胞的保護(hù)性免疫反應(yīng)，加強腸道內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells，Tregs)的功能。IL-33是否在HIV感染發(fā)揮作用及機制尚不清楚。目前對于HIV感染者IL-33表

5、達(dá)的研究結(jié)果并不一致，有研究發(fā)現(xiàn)HIV感染者血清中IL-33表達(dá)比健康對照顯著降低，有的研究則發(fā)現(xiàn)無變化，但是對于IL-33的可溶性受體sST2的表達(dá)研究較統(tǒng)一，HIV感染后顯著升高。HIV的感染可以導(dǎo)致CD4+T的減少和CD4+T、CD8+T細(xì)胞比例的失衡，IL-33及受體ST2是否在HIV感染中發(fā)揮作用，并影響CD4+T、CD8+T細(xì)胞的功能從而調(diào)節(jié)HIV感染免疫應(yīng)答目前尚不明確。
　　方法：44例無癥狀HIV感染者和20例H

6、IV陰性的健康對照者的血漿標(biāo)本，以及HIV感染者和正常人的細(xì)胞均來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院艾滋病研究所，感染者感染途徑多為男男性接觸。感染者的檢測時間點均為感染后120天，未接受高效抗逆轉(zhuǎn)錄治療（Highly active anti-retroviral therapy，HAART）治療，并且排除肝炎、腫瘤性疾病、自身免疫性疾病等。20例健康對照為隨機抽取的HIV抗體陰性、未暴露于HIV的健康人(Normal controls，NCs

7、)。實驗方法包括:1、T淋巴細(xì)胞絕對值計數(shù)將20μL CD4/CD8/CD3 TriTEST試劑分別加入絕對計數(shù)管中，用逆向加樣法加入50μL抗凝血，室溫避光15分鐘，加入免洗溶血素450μL，室溫，避光15分鐘。用FACSCalibur流式細(xì)胞儀上樣并用MultiSET軟件檢測進(jìn)行自動分析，計算CD4+T、CD8+T、CD3+T細(xì)胞絕對值及相應(yīng)比值。2、HIV病毒載量測定采用Roche公司The COBAS(@) AmpliPrep(

8、@)/COBAS(@)TaqMan(@)HIV-1 Test，v2.0試劑盒在COBAS(@)TaqMan(@)系統(tǒng)進(jìn)行全自動PCR反應(yīng)體系制備及病毒載量檢測。檢測下限為1 copy/mL。3、ELISA測定血漿中IL-33和sST2的含量Human IL-33 ELISA Kit和Human ST2/IL-1 R4 QuantikineELISA Kit:取出反應(yīng)板，每孔中加入反應(yīng)稀釋液;分別加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測血漿，封膜，按要求水平微板

9、震蕩儀上2小時（500 rpm±50 rpm）或;棄去反應(yīng)液并用配置好的洗液洗4遍，吸水紙上拍干;每孔加入耦合液封膜，按要求水平微板震蕩儀上2小時（500 rpm±50 rpm）;棄去反應(yīng)液并用配置好的洗液洗4遍，吸水紙上拍干;每孔中加入配置好的顯色劑，桌面上室溫避光孵育30分鐘;每孔中加入終止液，輕輕震蕩混勻;30分鐘內(nèi)上酶標(biāo)儀（單波長450nm），得出OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算待測血漿中的IL-33及sST2濃度。4、密度梯

10、度離心提取外周血單個核細(xì)胞抽取HIV-1感染者的外周血，將新鮮外周血與磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer saline，PBS)按照1∶1的比例充分混勻，將混合液緩慢勻速地加入到與全血等量的淋巴細(xì)胞分離液液面上，并進(jìn)行密度梯度離心。密度梯度離心后，小心吸取白膜層。5、細(xì)胞分選提取HIV感染者的新鮮外周血PBMCs，用Stem Cell公司的CD4+T、CD8+T細(xì)胞富集試劑盒陰性選擇目的細(xì)胞;使用流式分選儀FACS Aria

11、進(jìn)行CD3+T細(xì)胞分選。6、IL-33對CD4+T、CD8+T細(xì)胞IFN-γ分泌影響分選的CD4+T、CD8+T細(xì)胞用96孔U底板接種，每孔用完全1640（即含谷氨酰胺的1640內(nèi)加入10％FBS和1％青鏈霉素）培養(yǎng)細(xì)胞，200μl體系中含2*106個細(xì)胞，分別用anti-CD3/anti-CD28(5μg/mL，BDBiosciences)、gag pool(2μg/mL)或CD8+T細(xì)胞特異性的CEF肽段庫(0.03μg/mL，Mi

12、ltenyi Biotec，Germany)刺激細(xì)胞。同時分別設(shè)置重組IL-33（R&D公司）濃度梯度:0、100pg/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱共培養(yǎng)3天。用LSRⅡ檢測CD4+T、CD8+T細(xì)胞IFN-γ的分泌情況，用Flowjo7.6軟件進(jìn)行流式數(shù)據(jù)的分析。7、抗-ST2抗體對IL-33的阻斷實驗分選的CD3+T細(xì)胞中分別加入或不加入1 ng/mL的rhIL-33、0.2μg/

13、mL、2μg/mL、20μg/mL的抗-ST2抗體(Human ST2/IL-33R Antibody)或20μg/mL的同型對照Normal GoatIgG Control，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱共培養(yǎng)3天。用LSRⅡ檢測CD4+T和CD8+T細(xì)胞IFN-γ的分泌情況，用FlowJo7.6軟件進(jìn)行流式數(shù)據(jù)的分析。8、應(yīng)用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，用Graphpad5.0進(jìn)行繪圖。各組間實驗指標(biāo)的比較采用方差分析，相關(guān)性分

14、析采用Spearman秩相關(guān)檢驗，差異性檢驗采用T檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：⑴IL-33的ELISA檢測結(jié)果顯示，HIV急性期患者血漿中IL-33水平比健康對照升高(p=0.003)，CD4＜400cells/μL時IL-33的表達(dá)比CD4≥700cells/μL時顯著升高(p=0.046)，VL≥4.5 copies/mL時IL-33的表達(dá)比VL＜3.5 copies/mL時顯著升高(p=0.039)，即HI

15、V急性期患者IL-33的表達(dá)與疾病進(jìn)展呈正相關(guān)。⑵重組人IL-33與gag pool共培養(yǎng)促進(jìn)HIV患者CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ實驗結(jié)果顯示，患者CD8+T細(xì)胞在HIV特異性的刺激(gag pool)下加入不同濃度的重組人IL-33組均比不加組IFN-γ分泌升高或有升高的趨勢:100pg/mL(p=0.099)、1ng/mL(p=0.021)、10ng/mL(p=0.007)、100ng/mL(p=0.006)。而我們在CD8+T細(xì)

16、胞中加入HIV非特異性刺激物CEF，并加入不同濃度的重組人IL-33，實驗結(jié)果顯示加入重組人IL-33組也均比不加組IFN-γ分泌升高或有升高的趨勢:100pg/mL(p=0.008)、1ng/mL(p=0.007)、10ng/mL(p=0.063)、100ng/mL(p=0.006)。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了重組人IL-33與gag pool共培養(yǎng)可以促進(jìn)HIV患者CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ:100pg/mL(p=0.020)、1ng/mL

17、(p=0.012)、10ng/mL(p=0.071)、100ng/mL(p=0.120)。⑶sST2的ELISA檢測結(jié)果顯示，HIV患者血漿中sST2水平比健康對照升高(p=0.005)，且sST2與CD8的數(shù)量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.330，P=0.031）。⑷在體外實驗中加入不同濃度抗-ST2抗體后發(fā)現(xiàn)抗-ST2抗體可以抑制IL-33對CD4+T細(xì)胞的促進(jìn)功能:0.2μg/mL(p=0.016)、2μg/mL(p=0.001)、20μg