IL-33在HIV感染疾病進展中的作用及機制研究.pdf

1、目的：艾滋病即獲得性免疫缺陷綜合癥(Acquired Immune DeficiencySyndrome，AIDS)，是由人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)引起的一種嚴重傳染病。大部分HIV感染者感染8-10年后進入艾滋病期，但部分患者在感染HIV后短時間內(nèi)CD4+T細胞計數(shù)快速下降到350 cells/μL以下，引起這種CD4+T細胞快速下降的原因還不是很明確。大量數(shù)據(jù)表明，HIV不同

2、疾病進展與感染病毒的類型、免疫應答狀況、病毒與宿主相互作用中的免疫逃逸、宿主遺傳背景以及環(huán)境物理和生物因子等有關。白細胞介素1(Interleukin1，IL-1)是最早被發(fā)現(xiàn)的細胞因子之一，在細胞間相互作用、免疫調(diào)節(jié)及炎癥反應中起重要作用，其中IL-1家族中針對IL-1β、IL-1Ra及IL-18的中和活性單克隆抗體或重組蛋白已被批準成功應用于多種臨床疾病的治療。白細胞介素33(Interleukin33，IL-33)是白介素家族的最

3、新成員，最初作為一種新型“警報素”被研究。警報素是指病原生物感染及創(chuàng)傷等因素導致細胞損傷或死亡時釋放或分泌的一類宿主蛋白，可以募集和激活抗原提呈細胞，啟動固有免疫應答和適應性免疫應答。IL-33在內(nèi)皮和上皮細胞的細胞核內(nèi)表達，當創(chuàng)傷和感染引起內(nèi)皮細胞和上皮細胞損傷時，壞死細胞釋放的IL-33可以作為警報素，募集和活化具有相應受體的固有免疫細胞，如樹突狀細胞(DC)、巨噬細胞、肥大細胞、自然殺傷細胞(NK)和自然殺傷T細胞(NKT)細胞等

4、，使其釋放促炎性細胞因子、趨化因子、組胺和前列腺素等炎性介質，引發(fā)和促進炎癥反應，增強吞噬細胞和殺傷細胞功能。近期多項研究顯示，IL-33不僅發(fā)揮警報素作用，還可調(diào)控免疫應答過程，在機體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。動物實驗顯示IL-33可以驅動殺傷性T細胞的保護性免疫反應，加強腸道內(nèi)調(diào)節(jié)性T細胞(Regulatory T cells，Tregs)的功能。IL-33是否在HIV感染發(fā)揮作用及機制尚不清楚。目前對于HIV感染者IL-33表

5、達的研究結果并不一致，有研究發(fā)現(xiàn)HIV感染者血清中IL-33表達比健康對照顯著降低，有的研究則發(fā)現(xiàn)無變化，但是對于IL-33的可溶性受體sST2的表達研究較統(tǒng)一，HIV感染后顯著升高。HIV的感染可以導致CD4+T的減少和CD4+T、CD8+T細胞比例的失衡，IL-33及受體ST2是否在HIV感染中發(fā)揮作用，并影響CD4+T、CD8+T細胞的功能從而調(diào)節(jié)HIV感染免疫應答目前尚不明確。
　　方法：44例無癥狀HIV感染者和20例H

6、IV陰性的健康對照者的血漿標本，以及HIV感染者和正常人的細胞均來自中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院艾滋病研究所，感染者感染途徑多為男男性接觸。感染者的檢測時間點均為感染后120天，未接受高效抗逆轉錄治療（Highly active anti-retroviral therapy，HAART）治療，并且排除肝炎、腫瘤性疾病、自身免疫性疾病等。20例健康對照為隨機抽取的HIV抗體陰性、未暴露于HIV的健康人(Normal controls，NCs

7、)。實驗方法包括:1、T淋巴細胞絕對值計數(shù)將20μL CD4/CD8/CD3 TriTEST試劑分別加入絕對計數(shù)管中，用逆向加樣法加入50μL抗凝血，室溫避光15分鐘，加入免洗溶血素450μL，室溫，避光15分鐘。用FACSCalibur流式細胞儀上樣并用MultiSET軟件檢測進行自動分析，計算CD4+T、CD8+T、CD3+T細胞絕對值及相應比值。2、HIV病毒載量測定采用Roche公司The COBAS(@) AmpliPrep(

8、@)/COBAS(@)TaqMan(@)HIV-1 Test，v2.0試劑盒在COBAS(@)TaqMan(@)系統(tǒng)進行全自動PCR反應體系制備及病毒載量檢測。檢測下限為1 copy/mL。3、ELISA測定血漿中IL-33和sST2的含量Human IL-33 ELISA Kit和Human ST2/IL-1 R4 QuantikineELISA Kit:取出反應板，每孔中加入反應稀釋液;分別加入標準品和待測血漿，封膜，按要求水平微板

9、震蕩儀上2小時（500 rpm±50 rpm）或;棄去反應液并用配置好的洗液洗4遍，吸水紙上拍干;每孔加入耦合液封膜，按要求水平微板震蕩儀上2小時（500 rpm±50 rpm）;棄去反應液并用配置好的洗液洗4遍，吸水紙上拍干;每孔中加入配置好的顯色劑，桌面上室溫避光孵育30分鐘;每孔中加入終止液，輕輕震蕩混勻;30分鐘內(nèi)上酶標儀（單波長450nm），得出OD值，繪制標準品的標準曲線并計算待測血漿中的IL-33及sST2濃度。4、密度梯

10、度離心提取外周血單個核細胞抽取HIV-1感染者的外周血，將新鮮外周血與磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer saline，PBS)按照1∶1的比例充分混勻，將混合液緩慢勻速地加入到與全血等量的淋巴細胞分離液液面上，并進行密度梯度離心。密度梯度離心后，小心吸取白膜層。5、細胞分選提取HIV感染者的新鮮外周血PBMCs，用Stem Cell公司的CD4+T、CD8+T細胞富集試劑盒陰性選擇目的細胞;使用流式分選儀FACS Aria

11、進行CD3+T細胞分選。6、IL-33對CD4+T、CD8+T細胞IFN-γ分泌影響分選的CD4+T、CD8+T細胞用96孔U底板接種，每孔用完全1640（即含谷氨酰胺的1640內(nèi)加入10％FBS和1％青鏈霉素）培養(yǎng)細胞，200μl體系中含2*106個細胞，分別用anti-CD3/anti-CD28(5μg/mL，BDBiosciences)、gag pool(2μg/mL)或CD8+T細胞特異性的CEF肽段庫(0.03μg/mL，Mi

12、ltenyi Biotec，Germany)刺激細胞。同時分別設置重組IL-33（R&D公司）濃度梯度:0、100pg/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱共培養(yǎng)3天。用LSRⅡ檢測CD4+T、CD8+T細胞IFN-γ的分泌情況，用Flowjo7.6軟件進行流式數(shù)據(jù)的分析。7、抗-ST2抗體對IL-33的阻斷實驗分選的CD3+T細胞中分別加入或不加入1 ng/mL的rhIL-33、0.2μg/

13、mL、2μg/mL、20μg/mL的抗-ST2抗體(Human ST2/IL-33R Antibody)或20μg/mL的同型對照Normal GoatIgG Control，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱共培養(yǎng)3天。用LSRⅡ檢測CD4+T和CD8+T細胞IFN-γ的分泌情況，用FlowJo7.6軟件進行流式數(shù)據(jù)的分析。8、應用SPSS17.0軟件包進行統(tǒng)計分析，用Graphpad5.0進行繪圖。各組間實驗指標的比較采用方差分析，相關性分

14、析采用Spearman秩相關檢驗，差異性檢驗采用T檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　結果：⑴IL-33的ELISA檢測結果顯示，HIV急性期患者血漿中IL-33水平比健康對照升高(p=0.003)，CD4＜400cells/μL時IL-33的表達比CD4≥700cells/μL時顯著升高(p=0.046)，VL≥4.5 copies/mL時IL-33的表達比VL＜3.5 copies/mL時顯著升高(p=0.039)，即HI

15、V急性期患者IL-33的表達與疾病進展呈正相關。⑵重組人IL-33與gag pool共培養(yǎng)促進HIV患者CD8+T細胞分泌IFN-γ實驗結果顯示，患者CD8+T細胞在HIV特異性的刺激(gag pool)下加入不同濃度的重組人IL-33組均比不加組IFN-γ分泌升高或有升高的趨勢:100pg/mL(p=0.099)、1ng/mL(p=0.021)、10ng/mL(p=0.007)、100ng/mL(p=0.006)。而我們在CD8+T細

16、胞中加入HIV非特異性刺激物CEF，并加入不同濃度的重組人IL-33，實驗結果顯示加入重組人IL-33組也均比不加組IFN-γ分泌升高或有升高的趨勢:100pg/mL(p=0.008)、1ng/mL(p=0.007)、10ng/mL(p=0.063)、100ng/mL(p=0.006)。我們進一步發(fā)現(xiàn)了重組人IL-33與gag pool共培養(yǎng)可以促進HIV患者CD4+T細胞分泌IFN-γ:100pg/mL(p=0.020)、1ng/mL

17、(p=0.012)、10ng/mL(p=0.071)、100ng/mL(p=0.120)。⑶sST2的ELISA檢測結果顯示，HIV患者血漿中sST2水平比健康對照升高(p=0.005)，且sST2與CD8的數(shù)量呈負相關（r=-0.330，P=0.031）。⑷在體外實驗中加入不同濃度抗-ST2抗體后發(fā)現(xiàn)抗-ST2抗體可以抑制IL-33對CD4+T細胞的促進功能:0.2μg/mL(p=0.016)、2μg/mL(p=0.001)、20μg