HIV-1感染疾病長(zhǎng)期不進(jìn)展者CD8+T淋巴細(xì)胞非細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答作用的研究.pdf

1、目的：CD8+T淋巴細(xì)胞在機(jī)體抗HIV-1感染的免疫反應(yīng)中具有細(xì)胞毒性和非細(xì)胞毒性的免疫應(yīng)答(CNAR)。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)是細(xì)胞免疫反應(yīng)中殺滅HIV的主要效應(yīng)細(xì)胞，但是單純靠CTL介導(dǎo)的細(xì)胞免疫作用不足以保護(hù)機(jī)體免受HIV感染。CNAR功能通過分泌抗病毒因子抑制HIV感染細(xì)胞及HIV復(fù)制，在抗HIV感染中具有重要作用。近年來，國(guó)外關(guān)于CNAR功能的研究主要以無癥狀感染者為研究對(duì)象，對(duì)疾病長(zhǎng)期不進(jìn)展者(LTNP)和艾滋病期的患

2、者研究較少。LTNP是HIV-1感染超過10年，未經(jīng)任何抗病毒治療，CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)大于或等于500×10<'6>個(gè)/1，未出現(xiàn)艾滋病指征性癥狀的患者，疾病呈現(xiàn)長(zhǎng)期不進(jìn)展?fàn)顟B(tài)。CNAR功能可能在維持LTNP較好的免疫功能中發(fā)揮了重要作用，但其機(jī)制尚未明確。IL-15是一種多功能的細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)體內(nèi)NK細(xì)胞和記憶性T淋巴細(xì)胞分化和增殖，在機(jī)體抗病毒感染中發(fā)揮重要作用。國(guó)外研究顯示IL-15能夠增強(qiáng)無癥狀感染者CNAR功能，但CNA

3、R功能在LTNP中的變化以及是否與IL-15相關(guān)國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)道。本研究以中國(guó)HIV感染LTNP為對(duì)象，研究其外周血中CD8+T淋巴細(xì)胞CNAR功能的變化及IL-15對(duì)CNAR功能的影響，并與HIV組、AIDS組及健康對(duì)照組進(jìn)行比較，探討其與疾病進(jìn)展的關(guān)系。 方法: 1、研究對(duì)象 由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)艾滋病研究所、遼寧省疾病預(yù)防與控制中心以及吉林省疾病預(yù)防與控制中心、河南省疾病預(yù)防與控制中心艾滋病確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)Weste

4、rn blot試驗(yàn)確認(rèn)為HIV陽(yáng)性標(biāo)本52例，所有標(biāo)本均在未接受抗病毒治療前采集。根據(jù)HIV感染者CD4+T細(xì)胞數(shù)量和感染時(shí)間進(jìn)行分組。LTNP組：CD4+T淋巴細(xì)胞≥500個(gè)/μl，HIV感染10年以上，未經(jīng)抗病毒治療，無艾滋病指征性癥狀；HIV組：CD4+T淋巴細(xì)胞介于200-500個(gè)/μl之間，無艾滋病指征性癥狀；AIDS組：CD4+T淋巴細(xì)胞<200個(gè)/μl或出現(xiàn)艾滋病指征性癥狀。其中LTNP組17例，HIV組28例，AIDS組

5、7例，健康對(duì)照組8例。每例采集EDTA抗凝全血9ml。 2、T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù) 將20μlCD4/CD8/CD3 TriTEST試劑加入TruCOUNT管中，加入50μlEDTA抗凝血，室溫避光15min，加入免洗溶血450μl，室溫避光15min，用FACS MULTISET軟件檢測(cè)并進(jìn)行自動(dòng)分析，計(jì)算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值及相應(yīng)比值等。 3、病毒株TCID<,50>檢測(cè) HIV病

6、毒株為中國(guó)CDC參比實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)的實(shí)驗(yàn)室毒株SF33。提取健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood monouclear cells，PBMC)，PHA刺激3天，用RPMI-1640(含100U/ml IL-2)重懸，調(diào)整濃度為4×10<'6>個(gè)/ml，放入37℃、5％CO<,2>，孵箱中待用。在96孔板中部選12孔，每孔加入180μl RPMI-1640，PBMC 50μl。每孔加入200μl病毒，在板上做4倍系列稀釋。

7、3天后換液，第7天測(cè)p24，計(jì)算TCID<,50>。 4、CD4+T/CD8+T淋巴細(xì)胞的分選 用密度梯度離心法提取8例健康對(duì)照和52例HIV感染者的PBMC。采用德國(guó)Miltenyi公司的MACS免疫磁珠分選裝置，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。每1×10<'7>個(gè)細(xì)胞加20μl抗CD4或抗CD8免疫磁珠，10℃結(jié)合25min。300g離心10min，500μl緩沖液重懸細(xì)胞，經(jīng)LS柱子進(jìn)行陽(yáng)性分選。取少量分選后細(xì)胞加入6μl

8、CD4-FITC、6μl CD8-PE及61μl CD3-PerCP，用流式細(xì)胞儀Cellquest軟件檢測(cè)分選細(xì)胞純度。 5、T淋巴細(xì)胞的體外培養(yǎng) 用37℃水浴復(fù)蘇病毒。準(zhǔn)備15ml離心管，每管加入5×10<'5>個(gè)CD4+T細(xì)胞和600TCID<,50>的病毒，并用1ml吸管輕輕吹打20次，混勻后37℃、5％CO<,2>孵箱共培養(yǎng)3h。300g10min離心兩次，洗去游離的病毒，向每管加入0.5ml RPMI-164

9、0 (IL-2100U/ml)，重懸使細(xì)胞濃度為1×10<'6>個(gè)/ml。將預(yù)刺激72h的CD8+T細(xì)胞重懸，調(diào)整濃度到1×10<'6>個(gè)/ml。將CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞以2∶1、1∶1、0.5∶1的比例加入到48孔板中，固定CD4+T細(xì)胞的數(shù)量為0.4×10<'6>個(gè)/孔，每個(gè)濃度設(shè)2個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)定2個(gè)陰性對(duì)照。調(diào)整每孔的液體總量為1.2ml。37℃、5％CO<,2>孵育，每3天換液收集上清600μl，同時(shí)補(bǔ)充600μl R

10、PMI-1640，培養(yǎng)至15天。在實(shí)驗(yàn)孔中加入IL-15，濃度為300ng/ml，對(duì)照孔中只加入細(xì)胞，培養(yǎng)15天。 6、p24檢測(cè) 采用Biomerieux公司的p24檢測(cè)試劑盒，嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行。結(jié)果用pg/ml表示，最低檢測(cè)范圍是5pg/ml。 7、CNAR功能分析 將收集5次的上清p24值用Excel繪制折線圖，應(yīng)用Origin7.0軟件計(jì)算曲線下面積，根據(jù)下列公式計(jì)算出CNAR功能。CNAR

11、功能％=對(duì)照組面積-實(shí)驗(yàn)組面積/對(duì)照組面積×100％對(duì)照組面積. 8、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析： 用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)經(jīng)轉(zhuǎn)換后為正態(tài)分布。用方差分析(ANOVA)進(jìn)行不同組間的均值比較。用直線相關(guān)來比較CNAR功能與CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值及HIV-1 RNA病毒載量的相關(guān)性。 結(jié)論: 1.我國(guó)LTNP的CNAR功能高于HIV組、健康對(duì)照組和AIDS組。提示CNAR功能可能是我國(guó)HIV感染疾