中國人群HIV-1特異性CD8+T細胞應(yīng)答免疫優(yōu)勢表位的篩選鑒定.pdf

1、目前獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）已成為嚴重危害全人類健康的傳染病之一。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法能夠抑制HIV-1復(fù)制，使CD4細胞數(shù)量增加，在抗HIV-1感染中取得了一定效果。然而由于這些抗病毒藥物價格昂貴、毒副作用大、易產(chǎn)生HIV-1耐藥株以及患者依從性不好影響了抗病毒治療的效果。因此最終需要一種有效的疫苗來控制HIV-1的流行和傳播。大量研究表明細胞毒性T細胞（CTL）應(yīng)答在控制HIV-1中發(fā)揮重要作用。因而誘導(dǎo)強烈的CTL應(yīng)答成為

2、HIV-1疫苗需要考慮的重要因素之一。
　　本研究選擇中國大陸HIV-1感染者為研究對象，采用酶聯(lián)免疫斑點吸附試驗（ELISpot）檢測覆蓋HIV-1B、C亞型全基因序列肽段誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答反應(yīng)，分析中國HIV-1感染者HIV-1特異性CTL應(yīng)答特征；并進一步篩選鑒定一批CTL免疫優(yōu)勢表位。為適合中國人群的HIV-1候選疫苗設(shè)計和實驗研究提供理論依據(jù)。
　　主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　1.在對109例HIV-1感染者

3、B亞型特異性CTL應(yīng)答檢測后發(fā)現(xiàn)，413條肽段中382條（92.5％）能夠被至少一個HIV-1感染者體內(nèi)T細胞識別產(chǎn)生應(yīng)答。識別頻率居前4位的肽段均出自Nef蛋白。Gag-p24和Nef無論是識別頻率還是應(yīng)答強度均為最高的蛋白亞單位。相反，Vpu是最低的蛋白單位。
　　2.將HIV-1感染者按照CD4細胞計數(shù)劃分為CD4<200/μl組，200/μl400/μl組。將三組的CTL應(yīng)答進行比較發(fā)現(xiàn)，

4、CD4<200/μl的HIV-1感染者特異性CTL應(yīng)答不論是應(yīng)答強度還是廣度都顯著低于其他兩個組。細致分析發(fā)現(xiàn)CD4>400/μl組對Gag，Pol和Rev蛋白的應(yīng)答廣度和強度顯著高于CD4<200/μl（p=0.004和0.034；p=0.026和0.005；p=0.024和p=0.025）。針對Gag應(yīng)答水平的下降主要是由于Gag-p24和p15誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答的下降。而針對Pol應(yīng)答水平的下降則與其三個亞單位（RT，Pro和IN）

5、都有關(guān)。另外，針對gp120，Vpr和Vif三個蛋白亞單位最強的特異性CTL應(yīng)答出現(xiàn)在200/μl

6、L應(yīng)答與病毒載量存在微弱的負相關(guān)關(guān)系（p=0.031和0.035）。
　　3.比較了HIV-1B、C兩個亞型全基因序列肽庫誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答后發(fā)現(xiàn)，HIV-1B亞型感染者對兩個亞型肽段的應(yīng)答強度和識別肽段數(shù)量均無顯著差異。將肽段按照被識別能力分為單獨識別組和交叉識別組，分別進行Shannon熵值計算，結(jié)果顯示不同亞型間能夠被交叉識別的肽段優(yōu)先出現(xiàn)在具有亞型熵值更低和組間同源性更高的病毒序列區(qū)域（p=0.039和0.018）。

7、　　4.確定25個重疊肽段為免疫優(yōu)勢區(qū)，進一步切割成長度為12個氨基酸的短肽，ELISpot篩選出10個含候選表位的序列。用細胞內(nèi)細胞因子染色技術(shù)（ICS）通過效應(yīng)細胞（PBMC）與靶細胞（B-LCL）攜帶HLA-I類分子間匹配關(guān)系確定誘導(dǎo)CTL應(yīng)答效應(yīng)的表位HLA-I類等位基因限制性。結(jié)果顯示NEF-C-10肽段RPQVPLRPMTFK（RK12）由HLA-Cw04等位基因限制；VPR-B-2肽段GPQREPYNEWTL（GL12）和

8、GAG-B-13肽段HQRIEIKDTKEAL（HL13）由HLA-B40所限制；NEF-C-27肽段HMARELHPEFY（HY11），NEF-C-17肽段QGYFPDWQNYTP（QP12）和POL-C-85肽段QKTELQAIYLAL（QL12）由HLA-Cw07所限制；NEF-C-15肽段KKRQEILDLWVY（KY12）和GAG-C-46肽段RALGPGASLEEM（RM12）由HLA-A02所限制；ENV-C-76肽段QQ

9、HLLQLTVWGI（QI12）由HLA-Cw06所限制；NEF-C-27肽段RELHPEFYKDC（RC11）由HLA-A11所限制。
　　5.對12個氨基酸肽段進行計算機表位預(yù)測。根據(jù)預(yù)測結(jié)果合成候選表位，以及4條在候選表位兩端各或加或減一個氨基酸的肽段。通過濃度稀釋法再次用ELISpot實驗測定表位親和力，確定最佳表位。本研究共確定10個最佳表位，分別為RPQVPLRPM（RM9），REPYNEWTL（RL9），ARELHP

10、EF（AF8），ARELHPEFYK（AK10），QGYFPDWQNY（QY10），RQEILDLWVY（RY10），IEIKDTKEAL（IL10），RALGPGASL（RL9），QKTELQAIY（QY9）和QQHLLQLTV（QV9）。
　　6.對10個新鑒定表位應(yīng)答頻率檢測后發(fā)現(xiàn)，不同表位在表達特定HLA-I類等位基因的HIV-1感染者中應(yīng)答頻率差異顯著。應(yīng)答頻率最高的是HLA-Cw04限制的表位RM9（50％）。在對該表