HIV感染者調(diào)節(jié)T細(xì)胞HVEM表達(dá)與疾病進(jìn)展關(guān)系研究.pdf

1、目的:
　　 HIV感染直接攻擊人體免疫系統(tǒng),造成CD4+T細(xì)胞進(jìn)行性下降,免疫系統(tǒng)異?；罨Ｕ{(diào)節(jié)T(Regulatory T,Treg)細(xì)胞對激活應(yīng)答低,具有免疫抑制功能,可有效調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)活化,在HIV感染疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用,但由于研究人群及細(xì)胞標(biāo)志物的差異,目前對HIV感染者Treg細(xì)胞數(shù)量、比例及活化水平與疾病進(jìn)展關(guān)系的報(bào)道存在差異。HVEM(herpesvirus-entry mediator)是Treg細(xì)胞表面重

2、要分子,對Treg細(xì)胞免疫抑制性及無能性均具有重要意義,Treg細(xì)胞能否通過HVEM的表達(dá),調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答而影響HIV感染疾病進(jìn)展?本研究采用CD4+CD25+CD127low/-及CD4+CD25+FoxP3+兩種組標(biāo)志物定義Treg細(xì)胞,分析HIV感染者Treg細(xì)胞數(shù)量、比例及活化水平隨疾病進(jìn)展的變化,首次檢測并比較HIV感染者Treg細(xì)胞表面HVEM表達(dá)與健康人的差異,并分析了其與疾病進(jìn)展的相關(guān)性及變化的原因。
　　 方

3、法:
　　 1、研究對象
　　 43例無癥狀HIV慢性感染者(以下簡稱HIV組)均來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院紅絲帶門診,感染途徑多為男男性接觸,經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室病毒序列分析病毒以CRF01_AE亞型為主,感染時(shí)間一年以上,在檢測時(shí)蚓點(diǎn)尚未接受HAART治療,按CD4+T細(xì)胞數(shù)量分為高(CD4+T≥400/ul)、中(200/ul＜CD4+T＜400/ul)、低(CD4+T≤200/ul)三組。14例健康對照(以下簡稱NC組)

4、為隨機(jī)抽取的HIV抗體陰性、未暴露于HIV的健康人。
　　 2、Treg細(xì)胞比例、絕對值及活化水平檢測
　　 分別以CD4+CD25+CD127low/-(以下簡稱CD127low/-Treg)及CD4+CD25+FoxP3+(以下簡稱FoxP3+Treg)兩組標(biāo)志物定義并檢測Treg細(xì)胞。密度梯度離心法提取研究對象外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),向CD127low/-Treg樣本管加入抗CD3、CD4、CD25、CD12

5、7、CD62L的熒光抗體,向同型對照管加入相應(yīng)熒光標(biāo)記的同型對照抗體,冰上避光染色45分鐘,洗滌及固定細(xì)胞;復(fù)蘇凍存的PBMC,向FoxP3+Treg樣本管加入抗CD3、CD4、CD25標(biāo)記的熒光抗體,向同型對照管加入相應(yīng)熒光標(biāo)記的同型對照抗體,冰上避光染色45分鐘,沈滌細(xì)胞,按Treg細(xì)胞破膜染色試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行細(xì)胞破膜、胞內(nèi)染色(抗FoxP3標(biāo)記的熒光抗體),沈滌并固定細(xì)胞。使用BD LSRⅡ流式細(xì)胞儀及BD FACSDiva T

6、M軟件檢測并分析CD127low/-及FoxP3+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例,計(jì)算其與該樣本的CD4+T細(xì)胞絕對值檢測結(jié)果的乘積即得到Treg細(xì)胞絕對數(shù)量。
　　 3、Treg細(xì)胞HVEM表達(dá)檢測
　　 在Treg細(xì)胞檢測及同型對照管表面染色步驟中分別加入抗HVEM熒光抗體及相應(yīng)熒光標(biāo)記的同型對照抗體,冰上避光染色45分鐘,洗滌并固定細(xì)胞,使用BD LSRⅡ流式細(xì)胞儀及BD FACSDiva TM軟件檢測并分析CD

7、127low/-Treg細(xì)胞表面HVEM的表達(dá)情況。
　　 4、Treg細(xì)胞體外激活及HVEM動(dòng)態(tài)表達(dá)檢測
　　 以0.5ug/ml濃度抗CD3單克隆抗體包被U底96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,封板,4℃過夜,使用前PBS沈板3次。復(fù)蘇凍存的PBMC、計(jì)數(shù)并以0.5*106/孔加入細(xì)胞培養(yǎng)板并調(diào)整體積至200ul,同時(shí)設(shè)無刺激對照孔。分別于刺激后0、3、6、12、24、48、72小時(shí)等七個(gè)時(shí)間點(diǎn)收獲細(xì)胞并進(jìn)行表面染色,使用BD LSR

8、Ⅱ流式細(xì)胞儀檢測Treg細(xì)胞HVEM表達(dá)情況并繪制動(dòng)態(tài)表達(dá)曲線。
　　 5、Treg細(xì)胞HVEM功能試驗(yàn)
　　 密度梯度離心法提取人PBMC,采用FACSAria流式細(xì)胞儀分選CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞及CD3+/CD4+(CD4)或CD3+/CD41(CD8)效應(yīng)(T effective,Teff)細(xì)胞。將Treg細(xì)胞HVEM多克隆抗體或?qū)φ湛贵w孵育,離心沈去未結(jié)合的抗體。將封閉HVEM的Tre

9、g細(xì)胞以1:1比例分別與兩種Teff細(xì)胞混合,加入抗CD3單克隆抗體包被的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,培養(yǎng)24小時(shí),于收獲前10小時(shí)加入golgi stop。收獲并進(jìn)行胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(ICS),流式檢測Teff細(xì)胞IFN-γ表達(dá)。
　　 6、CD4+T細(xì)胞絕對值檢測
　　 將20μl BD公司CD4 FITC/CD8 PE/CD3 PerCP試劑加入絕對計(jì)數(shù)管中,逆向加入50μl混勻的抗凝全血,室溫避光染色15分鐘,加入1×免洗

10、溶血素450μl,室溫避光溶血15分鐘,應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀及MultiSET軟件檢測并分析得到CD4+T淋巴細(xì)胞的絕對值。
　　 7、HIV病毒載量測定
　　 以1100μl血漿采用標(biāo)準(zhǔn)版模板制備法提取RNA,采用Roche公司TheCOBAS(R)AmpliPrep(R)/COBAS(R)TaqMan(R)HW-1 Test試劑盒在Roche COBAS(R)AmpliPre(R)上提取核酸后手工轉(zhuǎn)

11、移到COBAS(R)TaqMan(R)系統(tǒng)進(jìn)行全自動(dòng)PCR反應(yīng)體系制備及病毒載量檢測。
　　 8、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)汁分析,數(shù)據(jù)以中位數(shù)表示,兩組間實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的比較采用Mann-Whitney U非參數(shù)檢驗(yàn),相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn),P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1、HIV感染者Treg細(xì)胞比例、絕對數(shù)量及活化水平
　　 HIV

12、組CD127low/-Treg細(xì)胞數(shù)量明顯低于NC組(P＜0.001),Treg細(xì)胞比例與健康對照無顯著性差異,但隨CD4+T細(xì)胞的下降呈明顯上升趨勢,在CD4+T細(xì)胞低組中上升明顯,較健康對照具有顯著性差異(P=0.033)。FoxP3+Treg細(xì)胞檢測結(jié)果同樣顯示,HIV組FoxP3+Treg細(xì)胞數(shù)量明顯低于NC組(P＜0.001),比例與NC組無明顯差異,亦呈上升趨勢,CD4+T低組上升顯著,比例明顯高于CD4+T細(xì)胞高組及健康對

13、照(P=0.040,P=0.046)。比較兩種表型Treg細(xì)胞,我們發(fā)現(xiàn)HIV感染者CD127low/-與FoxP3+Treg細(xì)胞數(shù)量及比例均具有強(qiáng)相關(guān)性(數(shù)量:r=0.893,P＜0.001;比例:r=0.649,P＜0.001)。通過對Treg活化水平的檢測,我們發(fā)現(xiàn)HIV組Treg細(xì)胞CD62L平均幾何熒光強(qiáng)度明顯低于NC組(P=0.007)。
　　 2、HIV感染者Treg細(xì)胞HVEM表達(dá)情況
　　 采用流式檢測

14、發(fā)現(xiàn),HIV組Treg細(xì)胞HVEM幾何平均熒光強(qiáng)度顯著低于NC組(P=0.014)。比較HIV及NC兩組CD62L+及CD62L-亞群Treg細(xì)胞HVEM表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)HIV組CD62L+及CD62L-兩亞群的表達(dá)均明顯下降,在CD62L-亞群下降更顯著(CD62L+:P=0.006;CD62L-組:P＜0.001)。
　　 3、HIV感染者Treg細(xì)胞HVEM動(dòng)態(tài)表達(dá)
　　 體外非特異性TCR刺激,觀察Treg細(xì)胞HV

15、EM的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況顯示,與未刺激對照相比,Treg細(xì)胞HVEM的幾何平均熒光強(qiáng)度呈活化早期下降,2-3天后表達(dá)回升的變化趨勢。
　　 4、封閉Treg細(xì)胞HVEM對Teff細(xì)胞分泌功能的影響
　　 分選健康人Treg及Teff細(xì)胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞能顯著抑制CD4+及CD8+Teff細(xì)胞活化(P=0.024,P=0,042),降低其IFN-γ產(chǎn)量,分選并封閉Treg細(xì)胞表面HVEM,Treg對Teff細(xì)胞抑制能力下

16、降,Teff細(xì)胞IFN-γ產(chǎn)生量增加。
　　 5、HIV感染者Treg細(xì)胞及HVEM與CD4+T細(xì)胞數(shù)量、HIV病毒載量相關(guān)性
　　 HIV感染者CD4+T細(xì)胞數(shù)量及HIV病毒載量檢測結(jié)果顯示,Treg細(xì)胞數(shù)量與CD4+T細(xì)胞數(shù)量顯著正相關(guān)(r=0.718,P＜0.001),與病毒載量無顯著相關(guān)性;Treg細(xì)胞比例與CD4+T細(xì)胞數(shù)量及HIV病毒載量相關(guān)性均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但表現(xiàn)出隨病毒載量增加而上升的趨勢(r=0.257

17、,P=0.096);Treg細(xì)胞HVEM表達(dá)與CD4+T細(xì)胞數(shù)量及HIV病毒載量相關(guān)性缺少統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但呈隨病毒載量升高而下降的趨勢(r=0.288,P=0.061)。
　　 結(jié)論:
　　 1、HIV組CD4+CD25+CD127low/-及CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞數(shù)量均下降、比例及活化水平上升,較NC組具有顯著性差異。
　　 2、HIV感染者Treg細(xì)胞表面HVEM表達(dá)水平下降,CD62L+及

18、CD62L-兩亞群HVEM表達(dá)均降低,較健康對照具有顯著性差異。
　　 3、體外非特異性刺激,Treg細(xì)胞HVEM的表達(dá)出現(xiàn)活化早期下降,后期回升的動(dòng)態(tài)表達(dá)過程,提示活化水平可以影響HVEM的表達(dá)。
　　 4、體外分選并封閉Treg細(xì)胞表面HVEM使Treg對Teff細(xì)胞抑制功能下降,提示HVEM是Treg細(xì)胞抑制機(jī)制之一。
　　 5、HIV感染者Treg細(xì)胞數(shù)量與CD4+T細(xì)胞數(shù)量顯著正相關(guān),比例呈隨HIV病毒