HIV感染者血漿IDO與IFN-α的含量及其與T細(xì)胞活化的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：持續(xù)的T細(xì)胞活化是目前公認(rèn)的驅(qū)動(dòng)HIV感染者疾病進(jìn)展的一個(gè)主要因素，但導(dǎo)致T細(xì)胞持續(xù)活化的機(jī)制尚不清楚，成為艾滋病免疫致病機(jī)制中亟待闡明的關(guān)鍵問(wèn)題。樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)是人體免疫系統(tǒng)中功能最強(qiáng)的一種專職抗原呈遞細(xì)胞(Antigen presenting cells，APC)，作為天然免疫細(xì)胞能夠誘導(dǎo)天然免疫應(yīng)答，并在連接天然免疫和獲得性免疫中有重要的作用。樹突狀細(xì)胞是唯一能夠活化初始的T細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)

2、胞。DC主要分為類漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(Plasmacytoid dendritic cell，pDC)和髓樣樹突狀細(xì)胞(Myeloid dendriticcell，mDC)二個(gè)亞群。pDC是樹突狀細(xì)胞的一個(gè)重要亞群，連接天然免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，在病毒刺激下能夠產(chǎn)生大量的IFN-α，IFN-α可以限制HIV的感染，發(fā)揮直接的抗病毒活性。然而大量的證據(jù)顯示，HIV感染者IFN-α活性增加也是持續(xù)免疫活化和免疫功能缺陷的一個(gè)原因。在HI

3、V感染過(guò)程中外周循環(huán)pDC數(shù)量減少且功能缺陷，經(jīng)過(guò)有效的抗病毒治療也不能完全恢復(fù)。在急性和慢性HIV感染者中，由于HIV誘導(dǎo)pDC高度活化，盡管循環(huán)中pDC數(shù)量減少，IFN-α的產(chǎn)生卻明顯增加。那么，在AIDS疾病進(jìn)展過(guò)程中，IFN-α發(fā)揮了有益的作用還是有害的作用？體外研究顯示，被HIV活化的pDC能夠產(chǎn)生吲哚胺2，3-二氧化酶（Indoleamine2，3-dioxygenase，IDO），正常情況下，IDO低水平表達(dá)，而在炎癥或感

4、染過(guò)程中其表達(dá)明顯增加。IDO具有很強(qiáng)的抑制T細(xì)胞增殖的作用，在IDO的作用下初始CD4+T細(xì)胞分化成具有抑制免疫應(yīng)答作用的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)。此外，pDC通過(guò)提呈抗原給T細(xì)胞，刺激T細(xì)胞活化，發(fā)揮適應(yīng)性免疫反應(yīng)。活化的T細(xì)胞能夠促進(jìn)pDC表達(dá)IDO，IDO通過(guò)降解局部色氨酸從而誘導(dǎo)對(duì)外源性的抗原耐受，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和致免疫耐受功能。可溶性CD14(soluble CD14，sCD14)是天然免

5、疫系統(tǒng)中的一個(gè)重要組成部分，是單核細(xì)胞活化的標(biāo)志物，也是微生物移位的標(biāo)志物，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。國(guó)外有研究報(bào)道，HIV感染者血清sCD14水平升高且與病情發(fā)展及病死率有關(guān)。CD40配體(CD40 Ligand，CD40L)主要表達(dá)于活化的T淋巴細(xì)胞表面，CD40L從活化的T細(xì)胞上脫落進(jìn)入外周血稱可溶性CD40L(sCD40L)。在慢性HIV感染中，sCD40L能夠誘導(dǎo)DC表達(dá)IDO，同時(shí)也能夠抑制pDC產(chǎn)生IFN-α，促進(jìn)免疫

6、活化。IDO通過(guò)誘導(dǎo)色氨酸分解代謝導(dǎo)致Th17/Treg比率失衡，有利于微生物移位。有研究顯示，在HIV急性和慢性的感染者中，外周pDCs中IFN-α mRNA表達(dá)增加，并且血清中IFN-α水平顯著升高。也有研究報(bào)道，HIV感染者經(jīng)過(guò)有效的ART治療后與未經(jīng)ART治療者比較，血漿IFN-α無(wú)顯著變化。所以我們檢測(cè)HIV感染不同時(shí)間血漿IFN-α水平，明確HIV感染不同時(shí)間血漿IFN-α含量。有文獻(xiàn)報(bào)道，HIV感染者外周血單個(gè)核細(xì)胞、扁桃

7、體、淋巴結(jié)等組織中IDO mRNA表達(dá)增加，但有關(guān)HIV感染者血漿IDO水平尚未見報(bào)道;也有文獻(xiàn)報(bào)道，血漿sCD40L、sCD14水平升高，并且sCD40L水平與T細(xì)胞活化表面標(biāo)志呈正相關(guān)。國(guó)內(nèi)外研究顯示，HIV感染者T細(xì)胞活化是一個(gè)多種因素參與的復(fù)雜過(guò)程，參與T細(xì)胞活化的血漿多種可溶性分子可能有多種。目前尚未見有關(guān)HIV感染者血漿IDO、IFN-α、sCD14水平與T細(xì)胞活化水平的相關(guān)性的報(bào)道。最近提出的HIV感染者免疫活化假說(shuō)也提示

8、體內(nèi)T細(xì)胞活化在不同時(shí)間水平不同，因此提示我們要研究不同時(shí)間的IFN-α、IDO與T細(xì)胞活化關(guān)系。本文以HIV感染6個(gè)月內(nèi)、1-2年，HAART治療6個(gè)月、治療1-2年者為研究對(duì)象，檢測(cè)其血漿中IFN-α、IDO含量與CD4+T細(xì)胞、CD8+T活化水平，揭示IDO、IFN-α、sCD40L、sCD14含量與T持續(xù)細(xì)胞活化的相關(guān)性，對(duì)進(jìn)一步闡明HIV感染疾病的致病機(jī)制有重要作用并為HIV的免疫治療提供依據(jù)。
　　方法：⑴選取HIV感

9、染者血漿共77例，根據(jù)感染及治療時(shí)間對(duì)其進(jìn)行分組，其中HIV感染6個(gè)月內(nèi)者28例，HIV感染1-2年者18例，入選標(biāo)準(zhǔn):未接受HAART治療，感染時(shí)間6個(gè)月內(nèi)、1-2年者。HIV感染者治療6個(gè)月13例，HIV感染者治療1-2年者18例，入選標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的HAART治療6個(gè)月、1-2年者。77例HIV感染者均來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院紅絲帶門診，經(jīng)免疫印跡試驗(yàn)確認(rèn)為陽(yáng)性，平均年齡為27.3（27.3±6.74）歲。健康對(duì)照組(Heal

10、thy Control，HC)22例，平均年齡28(22.5±3.35)歲，入選標(biāo)準(zhǔn):HIV抗體陰性，血常規(guī)及肝腎功正常，乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗體陰性，無(wú)免疫系統(tǒng)疾病，未暴露于HIV的正常人。納入本課題研究的所有患者均簽署了知情同意書，并通過(guò)了中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。⑵CD4+T細(xì)胞絕對(duì)值的檢測(cè)。將20μl BD公司CD4/CD8/CD3 TriTEST試劑分別加入絕對(duì)計(jì)數(shù)管中，逆向加入50μl混勻的抗凝全血，室

11、溫避光染色15分鐘，加入1×兔洗溶血素450μl，室溫避光溶血15分鐘，應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀及MultiSET軟件檢測(cè)并分析得到CD4+T淋巴細(xì)胞的絕對(duì)值。⑶HIV病毒載量測(cè)定。取1ml EDTA抗凝血漿，采用Roche公司COBAS(@)AmpliPrep(@)/COBAS(@) TaqMan(@)System自動(dòng)載量?jī)x上以實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)定病毒載量。全部操作按照操作說(shuō)明書進(jìn)行。⑷檢測(cè)血漿中IDO，IFN-α

12、，sCD14，sCD40L。稀釋血漿樣本（sCD14稀釋200倍，其余原倍），配制洗液、標(biāo)準(zhǔn)品、抗體、生物素。用ELISA kit檢測(cè)IDO, IFN-α, sCD14, sCD40L濃度[IDO(cusabio), IFN-α(ebioscience), sCD40L(ebioscience)，sCD14(R&D system)]按照說(shuō)明書方法進(jìn)行檢測(cè)。⑸統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用SPSS17.0和G-raphPad5.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖

13、形制作，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)表示，用方差分析(one-way AVOVA)進(jìn)行不同組間的均值比較。不符合正態(tài)分布的用中位數(shù)表示。組間的比較采用T檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：①HIV感染未經(jīng)HAART治療者血漿中IDO、sCD40L含量增加;IFN-α、sCD14含量無(wú)顯著變化。HIV感染≤6個(gè)月和HIV感染1-2年未經(jīng)HAART治療者血漿中IDO、sCD40L含量顯著

14、高于健康對(duì)照組(P=0.0008，P=0.0007;P=0.0001，P=0.0032);而IFN-α、sCD14表達(dá)與健康對(duì)照組無(wú)顯著差異。②HIV感染者經(jīng)HAART治療后血漿中IDO、sCD40L含量顯著降低(P=0.0252，P=0.003);IFN-α含量無(wú)顯著變化，sCD14含量顯著高于健康對(duì)照組和未治療患者組(P=0.0015，P=0.0113)。③HIV感染不同時(shí)間血漿IDO、IFN-α、sCD40L、sCD14相關(guān)性。H

15、IV感染者血漿中IDO與IFN-α、sCD14無(wú)相關(guān)性;HIV感染≤6個(gè)月未經(jīng)HAART治療者血漿中IFN-α與sCD14呈正相關(guān)(P=0.03，r=0.4651);HIV感染1-2年未經(jīng)HAART治療者血漿中IDO與sCD40L呈正相關(guān)(P=0.0412，r=0.4853);HIV感染經(jīng)HAART治療1-2年者血漿中IDO與sCD40L呈正相關(guān)(P=0.0254，r=0.5245)。④HIV感染未經(jīng)HAART治療者T細(xì)胞活化水平增加。

16、感染≤6個(gè)月者外周血中CD38+CD4+T細(xì)胞、CD38+HLA-DR+CD4+T細(xì)胞、CD38+CD8+T細(xì)胞、HLA-DR+CD8+T細(xì)胞、CD38+HLA-DR+CD8+T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著高于健康對(duì)照(P=0.0003，P=0.017，P＜0.0001，P=0.0002，P＜0.0001);感染1-2年者外周血中 CD38+CD4+T細(xì)胞、HLA-DR+CD4+T細(xì)胞、CD38+HLA-DR+CD4+T細(xì)胞、CD38+CD8+T細(xì)胞

17、、HLA-DR+CD8+T細(xì)胞、CD38+HLA-DR+CD8+T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著高于健康對(duì)照(P＜0.0001，P=0.0241, P＜0.0001, P＜0.0001, P＜0.0001, P＜0.0001)。⑤HIV感染未經(jīng)HAART治療者血漿IDO、sCD40L與T細(xì)胞活化呈正相關(guān)。感染≤6個(gè)月者血漿中IDO的含量與T細(xì)胞活化呈正相關(guān)(P=0.057，r=0.5849)。感染1-2年者血漿中sCD40L含量與T細(xì)胞活化呈正相關(guān)(P

18、=0.0353，r=0.5648)。⑥HIV感染者血漿IDO、IFN-α、sCD40L、sCD14與CD4+T細(xì)胞、病毒載量相關(guān)性。HIV感染≤6個(gè)月未經(jīng)HAART治療者血漿中sCD14的含量與CD4+T細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān)(P＜0.0001，r=-0.8913)，而IDO、IFN-α、sCD40L與CD4+T細(xì)胞數(shù)量無(wú)相關(guān)性;HIV感染1-2年未經(jīng)HAART治療者血漿中IDO的含量與CD4+T細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān)(P=0.021，r=-0.5