腎移植受者HCMV感染與BAFF信號活化的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　研究腎移植受者人巨細胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）感染與B細胞活化因子（B cell activating factor belong to the TNF family,BAFF）信號的相關(guān)性。
　　方法：
　?、僖詠碓弘S訪的腎移植受者為研究對象，共采集113例患者抗凝外周血（EDTA-Na2抗凝）和尿液樣本。采用real-time PCR法檢測尿液中HCMV DNA水平。

2、
　?、趹?yīng)用real-time PCR法檢測外周血單個核細胞中BAFF、BAFF-R、TLR9、NLRC5、TACI等HCMV-TLR信號和BAFF信號通路中相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄本水平；PCR芯片技術(shù)對TLR信號通路、NF-κB信號通路，以及細胞因子-細胞因子受體通路中共88個基因進行研究，以篩選腎移植受者HCMV DNA陽性組和陰性組的差異表達基因。健康志愿者為對照。
　?、跡LISA法檢測血清sBAFF和總IgG水平；間接熒光

3、免疫試驗（IFA）檢測血清中抗HCMV pp65 IgG、IgM抗體水平，流式熒光法（Luminex）檢測血清抗人類白細胞抗原HLA抗體和抗MICA抗體水平（抗HLA-Ⅰ&Ⅱ&MICA抗體）。
　?、懿捎肧PSS17.0統(tǒng)計軟件包進行分析。兩個獨立樣本均數(shù)間的比較采用雙側(cè)t檢驗；相關(guān)性分析采用Spearman法及Pearson法；P<0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　?、?13例來院隨訪腎移植病人中，尿HC

4、MV DNA>10,000拷貝/ml為12例，歸為陽性組；HCMV DNA<10,000拷貝/ml的為83例，以及未出現(xiàn)擴增的18例，歸為陰性組。
　?、贓LISA結(jié)果顯示，陽性組患者血清sBAFF、總IgG水平顯著高于陰性組（928±360 pg/ml vs511±298 pg/ml,P<0.05;26,260±15,960μg/ml vs9,944±7,365μg/ml, P<0.05）；IFA結(jié)果顯示，陽性組患者血清抗HCM

5、V pp65 IgG水平顯著高于陰性組（P<0.05）；陽性組中尿HCMV DNA拷貝數(shù)與sBAFF呈正相關(guān)（r=0.988,P<0.05），sBAFF與血清中總IgG呈正相關(guān)（r=0.625, P<0.05）。
　?、跮uminex檢測結(jié)果顯示，陽性組中抗HLA-Ⅰ&Ⅱ&MICA抗體的陽性率為46.2％，陰性組為12.5%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　?、躵eal-time PCR發(fā)現(xiàn)，與尿HCMV DNA陰性組比較，陽性組BA

6、FF mRNA水平顯著增高（P<0.05），其余分子（BAFF-R、TLR-9、NLRC5、TACI等）的表達未出現(xiàn)顯著差異；基因芯片檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表達差異基因共有46個，其中陽性組與陰性組相比較表達上調(diào)的基因有2個（BAFF-R、ICAM1），表達下調(diào)的基因22個（TLR-9、NLRC5、LIGHT等）；陽性組與健康對照組相比較，表達上調(diào)的基因有2個（IFN-γ、ICAM1），表達下調(diào)的基因8個（CCL3L1、IL12B、ILIR1等

7、）；陰性組與健康對照組相比較表達上調(diào)的基因有11個（IFN-γ、IRAK4、NF-κB2等），表達下調(diào)的基因1個（BAFF-R）。
　　結(jié)論：
　　腎移植受者HCMV感染后，HCMV-TLR信號活化可能引發(fā)或促進BAFF信號活化；HCMV-TLR信號與BAFF信號獨立或協(xié)作參與移植腎損傷。
　　第二部分
　　目的：體外探索HCMV-TLR9信號與BAFF信號串話的可能機制和效應(yīng)。
　　方法：
　?、貶

8、CMV感染HFL-1細胞，以無HCMV感染的HFL-1細胞作對照。在感染第1，3，5，7天時收獲細胞，提取全蛋白。Western Blot法分析NLRC5、TLR9、TRAF6、IRAK4等蛋白在各不同時相的表達水平變化。
　?、贖CMV直接感染人扁桃體B淋巴細胞，或以HCMV感染后的HFL-1細胞與扁桃體B淋巴細胞共培養(yǎng)。在共培養(yǎng)第1，3，5，7天后收獲細胞和培養(yǎng)上清。流式分析各個時相B細胞的凋亡率及CD19+、BAFF+、BA

9、FF-R+、TACI+、BCMA+的表達強度；ELISA檢測不同實驗分組細胞培養(yǎng)上清的IgG分泌水平。另外，用5μg/ml CpG ODN2006及其陰性對照，2.5μg/ml CpG ODN4084-F和50μg/ml Poly(I:C)，及200 ng/ml重組BAFF蛋白體外作用于B細胞作為對照。
　?、鄄捎弥泻托钥笲AFF-R抗體在HCMV或CpG ODN2006感染B細胞之前或之后阻抑BAFF信號，繼續(xù)培養(yǎng)5天，收集相應(yīng)

10、的細胞和細胞培養(yǎng)上清，分別用流式和ELISA檢測B細胞凋亡率和分泌IgG水平，以分析HCMV感染、BAFF信號串話對B細胞生長及功能的影響；以HCMV、CpG ODN2006、抗BAFF-R抗體單獨作用作為對照，以不加任何刺激劑作為空白對照。體外實驗用來分析HCMV感染對B細胞生物學(xué)功能的影響。
　?、懿捎肧PSS17.0統(tǒng)計軟件包進行分析。兩個獨立樣本均數(shù)間的比較采用雙側(cè)t檢驗；多組實驗間采用ANOVA方法進行兩兩比較；P<0.

11、05被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　?、賅estern Blot結(jié)果顯示HCMV感染HFL-1細胞后，TLR9的表達水平隨感染時間先升高后下降，TRAF6和IRAK4則隨時間呈下降趨勢（時相間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義），NLRC5水平則未出現(xiàn)明顯變化；對照組中各蛋白表達水平隨時間均未出現(xiàn)明顯變化。
　?、谂cHCMV感染的HFL-1細胞共培養(yǎng)的B細胞凋亡率在培養(yǎng)的第1-3天和第5-7天間出現(xiàn)顯著的上升，但在第0-1天、第

12、3-5天之間則出現(xiàn)平臺期；與正常HFL-1細胞共培養(yǎng)的B細胞凋亡率呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢。HCMV直接刺激B細胞，B細胞的早期凋亡率在第1-5天未出現(xiàn)明顯上升；CpG ODN2006直接刺激B細胞，B細胞的早期凋亡率在第0-1天下調(diào)，第1-5天緩慢上調(diào)；CpG ODN2006 Control和rhBAFF直接刺激B細胞，B細胞的早期凋亡率與不加任何制劑刺激相比無顯著差異；CpG ODN4084-F、Poly(I:C)刺激的B細胞的凋亡率持續(xù)上

13、升，且在相應(yīng)的時間點高于對照組；對照組中未用任何制劑刺激的B細胞早期凋亡率持續(xù)上升。
　　③HCMV直接或間接感染 B細胞，B細胞表面BAFF-R持續(xù)高水平表達；受 rhBAFF和 CpG ODN2006刺激的B細胞 BAFF-R表達水平與HCMV感染類似。CpG ODN2006 Control、CpG ODN4084-F、Poly(I:C)刺激組和對照組中B細胞BAFF-R表達水平未出現(xiàn)明顯規(guī)律。B細胞表面BAFF及其受體TAC

14、I、BCMA的表達水平在各實驗組中均未發(fā)現(xiàn)明顯變化趨勢。
　?、蹾CMV刺激B細胞之前阻抑BAFF信號，B細胞凋亡率上升，但IgG分泌水平無顯著變化；CpG ODN2006刺激B細胞之前阻抑BAFF信號，B細胞凋亡率顯著上升，IgG分泌水平顯著下降；HCMV、CpG ODN2006、抗BAFF-R抗體單獨刺激B細胞對其早期凋亡率無顯著影響，HCMV、CpG ODN2006單獨刺激B細胞后B細胞IgG分泌水平上調(diào)。
　　結(jié)論：